从M13噬菌体模板合成非固定长度的单链DNA探针

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段 寡核苷酸引物 模板 DNA

洗脱缓冲液 甲酰胺染色缓冲液 NaOH 探针合成缓冲液

聚丙烯酰胺凝胶 空气孵箱或水浴摇床 沸水浴 一次性接种棒 加热板 塑料 snap-cap 管

一、材料

1. 缓冲液和溶液

洗脱缓冲液（1X SSPE 含 0.5% SDS）

甲酰胺染色缓冲液

MgCl₂ ( 1 mol/L)

NaOH (10 mol/L)

3X 探针合成缓冲液（dATP、dTTP 和 dGTP ( 各 62 pmol/L），0.5 mg/ml 牛血清白蛋白（组分V，Sigma 公司），625 μmol/L DTT，32 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，6.5 mmol/L MgSO₄）

2. 酶和缓冲液

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段

3. 凝胶

含 7 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺凝胶（5 %)

4. 核酸与寡核苷酸

寡核苷酸引物（M13 噬菌体通用引物或定制的寡核苷酸）

模板 DNA

5. 放射性复合物

[α-³²P] dCTP ( 10 mCi/ml，800~3000 Ci/mmol)

6. 专用设备

预热至 50℃ 的空气孵箱或水浴摇床

沸水浴

一次性接种棒

多孔（fritted) 柱（Quik-sep 柱，Isolab 公司）

预热至 57℃ 的加热板

塑料 snap-cap 管（12 X 17 mm)

二、方法

1. 在 0.5 ml 微量离心管中混合：

单链模板（M13 噬菌体或噬粒 DNA)  

( ~0.15 pmol，~0.1 μg/μl）               0.3 μg

寡核苷酸引物                                  1 μl

25 mmol/L MgCl                              1 μl

如可能，可在每次实验中设阳性对照反应，其中含有对照 DNA 模板或经实验证实反应良好的寡核苷酸。

2. 盖紧管盖，在 57℃ 加热板上温育反应物 5~10 min。

3. 将微量管从加热板移至冰上，再加入如下混合物：

3X 探针合成缓冲液                4 μl

10 mCi/ml [α-³²P] dCTP

( 比活性 3000 Ci/mmol）       3 μl

Klenow 片段（约 2.5 单位）  0.5 μl

轻敲管壁以混合各组分，以最大速度离心 1~2s 使所有液体沉降到管底，37℃ 温育反应物 40 min。

4. 在进行引物反应的同时，可灌制含 7 mol/L 尿素的 5% 聚丙烯酰胺凝胶（用 1X TBE 缓冲液配制）。凝胶的厚度为 1.5 mm，长度至少为 15 cm，加样孔宽度为 2.5 cm。20~25 V/cm 电泳 15 min，以除去加样孔中的过硫酸胺。

5. 加入 25 μl 的甲酰胺染料缓冲液，在沸水浴中加热反应物 3~5 min，以终止引物延伸反应。将微量管移至冰上，加入 1 μl 1 mol/L NaOH。

6. 用注射器吸取 1X TBE 缓冲液，冲掉加样孔中的尿素和松散的聚丙烯酰胺凝胶碎片后，立即将 DNA 样品加至加样孔中。电泳 30 min，电压为 20~25 V/cm，使模板 DNA 与放射性标记探针分离。

7. 电泳 30 min 后，分离取下凝胶，将凝胶包在 Saran Wrap 包装膜中，通过放射性自显影定位放射性标记的 DNA。将凝胶在 X 线片上曝光 1 min。

8. 用清洁的剃须刀片从凝胶中切下有放射活性的区带，放入12 X 17 mm 的带弹性盖 (snap-cap) 的塑料管底部，用一次性接种棒捣碎后，加入 1~2 ml 洗脱缓冲液，50℃ 下振荡 >3 h。

9. 将洗脱液吸入多孔（fritted) 柱，将柱置于塑料 snap-cap 管，用台式离心机离心 1~2 min。用液体闪烁计数仪检测 1 μl 放射性探针的放射活性。