以PCR为基础的相关技术

　　（一）巢式PCR

　　定义：

　　是对靶基因进行二次扩增，第二次扩增用的模板就是第一次的扩增产物。

　　应用：

　　可以得到足够和特异性的扩增产物，在靶基因表达量比较低或者一些其他原因导致的，使用常规的PCR无法得到理想的产物得时候。

　　注意事项：

　　（1）第二次扩增的时候，必须至少有一条引物是另外设计的。不能直接用第一次扩增时的引物，为保证最终产物的特异性。

　　（2）第一次扩增得时候应该进行较少的循环次数，以合适的产物浓度作为第二次扩增的模板。

　　（二）逆转录PCR

　　定义：

　　由于DNA耐高温聚合酶是不能以总RNA或者mRNA为模板进行核算扩增，必须先将总RNA或者mRNA进行逆转录生成cDNA。再用此做为模板进行PCR扩增。

　　应用：

　　合成cDNA探针、cDNA克隆、检测RNA病毒和分析基因表达等。

　　逆转录生成cDNA的方式：

　　（1）可用随后进行PCR扩增的引物为逆转录的印物，可以与目的mRNA的3”末端互补，进行逆转录合成次DNA。

　　（2）以合成的寡聚脱氧胸苷酸为引物，mRNA3”端多聚腺苷酸尾互补，在逆转录酶的作用下合成cDNA。

　　（3）以人工合成的随机序列六核苷酸混合物为模板，这些引物可以和mRNA链上面任何位置的特异序列互补。引发逆转录反应。可以得到较完整的次DNA。

　　（三）定量PCR

　　定义：

　　是一种半定量又称相对定量PCR技术

　　注意事项：

　　（1）需要引入内参照系统

　　（2）需确保反应处于平台期时对产物进行检测

　　（3）在继续定量分析时应该先对扩增产物进行电泳分离

　　（四）多重PCR

　　定义：

　　是需要在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中同一靶基因的多个不同序列的片段或者多个不同靶基因的片段。

　　应用：

　　可以检测基因较大，突变较多的样本。例如迪谢内肌营养不良的治病基因。

　　（五）单细胞PCR

　　定义：

　　样本主要取自于生物体的组织或者是体液，从其中提取到DNA或者mRNA经过转录后，合成cDNA作为扩增的模板。

　　应用：

　　神经生物学、胚胎发育、干细胞生物学和基因克隆和文库的构建，免疫学肿瘤等各种研究领域。在基因的定性和定量检测中，也起到了广泛的作用。

　　单细胞P C R的技术，关键是如何获得单个完整的细胞。

　　目前针对这一问题比较常用的方法包括以下几个：

　　膜片钳技术，激光显微切割技术以及流式细胞仪分选和显微吸管技术。

　　注意：

　　常规的PCR技术是需要从样本中提取提取和纯化DNA或者RNA，但是从单个细胞中获得材料极少为避免模板的损失，一般不进行纯化，而是进行细胞裂解cDNA合成乃至PCR的操作都需要在一个反应管中进行。

　　（六）原位PCR

　　定义：

　　是需要从组织细胞中提取出模板DNA或者RNA还要在不破坏细胞结构的情况下，在细胞原位进行PCR扩增。从而提高了检测的灵敏度。

　　引用：

　　（1）在肿瘤性疾病中研究细胞中原癌基因和抑癌基因表达的变化和表达量对都改变对细胞功能的影响。

　　（2）某些细胞中特异性表达以及在亚细胞结构中的定位。病毒感染中哪些细胞是病毒感染的原发灶等问题。

　　原位PCR与常规PCR的主要区别在于模板的制备。

　　原位杂交PCR技术是在原位杂交细胞定位技术上与PCR技术的相结合，其检测灵敏度大大提高。