体外诊断中微纳米材料，如何高效表征分析？

微纳米材料如胶体金，量子点，荧光微球，超顺磁性微球等，已经广泛应用于体外诊断领域。广义上，微纳米材指三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或者由纳米尺度范围的物质为基本结构单元构成的材料的总称。由于纳米尺寸材料具有异于宏观物质的表面效应，小尺寸效应，量子限域效应，因而具有与普通材料迥异的光、电、磁、热力学等性能。如胶体金，量子点，荧光微球，超顺磁性微球等微纳米材料，已经广泛应用于体外诊断领域。微纳米材料在体外诊断中主要有两方面的作用，一是作为信号标记物，如量子点、胶体金、荧光微球等，由于本身具有特殊的光学性质，可以为检测提供光学信号。二是作为反应载体，这是由于微纳米材料具有极高的比表面积，能够增加分子间反应碰撞几率，加快反应速度，提高灵敏度。

虽然微纳米材料已经广泛应用于体外诊断领域，但是微纳米材料的表征手段却尚未完全被体外诊断人员所熟悉，没有更好地引入到研发、分析问题当中。本期我局主要探讨微纳米颗粒的重要参数以及如何更好地表征分析。

△不同粒径颗粒对应的体外诊断应用，以及对应的表征方法

粒径是决定纳米材料特殊性质的关键。相同组分的量子点材料，在不同粒径下，其发光波长会有所区别。粒径小的磁性微球较粒径大的磁性微球有更高的比表面积，意味着同样质量浓度的情况下，小颗粒拥有更多的颗粒和表面积，灵敏度也可能会更高。那么表征颗粒的粒径和表面形貌的手段通常有哪些呢？我们如何才能“看到”如此渺小的颗粒呢？

透射电子显微镜

Transmission Electron Microscope，TEM

透射电子显微镜简称透射电镜，是把经过加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子穿过样品，与原子碰撞而改变方向。通过收集分析电子信息，反应出样品内部结构信息。光学显微镜由于波长限制，无法观察小于200 nm的细微结构。由于电子束波长更短，因此透射电镜拥有更高的分辨能力，能够达到0.2 nm，最新的球差校正透射电镜分辨率甚至能够达到50 pm，能够看到材料内部的原子排布。因此，透射电镜是表征分析纳米颗粒的重要手段，如2~10 nm的量子点，50 nm的胶体金等。

△高分辨率透射电镜下的量子点[1]

扫描电子显微镜

Scanning Electron Microscope，SEM

扫描电子显微镜简称扫描电镜，同样是利用电子束对样品进行表征分析，不同的是扫描电镜通过收集分析样品散射出的电子信息，对样品形貌进行表征。扫描电镜能够呈现出样品的三维结构，表面形貌，是微米、亚微米材料的重要分析手段。如1μm的DynaMyOne磁珠，能够在扫描电镜下清楚的显示出表面形貌，甚至能够看到组成微球的氧化铁纳米颗粒形成的纳米簇。如图3，在扫描电镜下可以清楚的显示出微米或亚微米颗粒的表面形貌。其中A是东纳公司制备磁珠，从图中可以看到，国产磁珠粒径控制已经达到国际一流水平；B是知名品牌Dynabeads磁珠，可以清楚的看到由更小的纳米簇聚集形成的粗糙表面；C可以清楚的看到类似月球表面结构；D是粒径约180 nm的聚苯乙烯微球，在电镜下形成排布。

△扫描电镜下的微米颗粒，A东纳公司磁珠；B DynabeadsMyone；C一款进口磁珠；D聚苯乙烯微球。

粒度分析仪

透射电镜和扫描电镜都需要测试干燥状态下的样品，无法对颗粒在溶液中的真实状态进行表征分析。采用粒度分析仪能够对溶液中颗粒进行直接表征分析。常用的粒度分析仪大致有两类，一类是动态光散射，另一种是颗粒计数器。

透过含有纳米颗粒溶液的激光，受到溶液中颗粒布朗运动的影响而波动，通过收集分析波动的激光信号，分析溶液中颗粒大小以及聚集状态，这种方法称之为动态光散射（DynamicLightScattering，DLS）。一个经典的理论是，分散在溶液中的颗粒表面附着有一层薄的电偶极，类似一层保护层，并随着颗粒在溶剂中运动，这个半径又被称之为流体动力学半径（HydrodynamicDiameter）。颗粒在溶液中的流体动力学半径对颗粒的运动以及稳定性有重要影响，流体动力学半径越厚，颗粒越稳定。流体动力学半径与颗粒表面亲水性，以及溶液性质有关。

△经典的颗粒在溶液中的流体动力学半径示意图

动态光散射测试颗粒在溶液中的流体动力学半径，包括颗粒本身半径，表面修饰层（如抗体、表面活性剂等），以及电偶极层，能够真实反应颗粒在溶液中的大小，稳定性，以及聚集状态。蛋白质作为大分子，在溶液中也可视为颗粒存在，用动态光散射也能够测试出纯蛋白在溶液中的大小。如图，采用Nicomp380能够区别出单体，二聚体，三聚体蛋白的溶液颗粒尺寸。

△上图为220nm，340nm两种聚苯乙烯颗粒的混合体，经动态光散射测试的粒径分布图；下图红色峰为单体蛋白，蓝色为二聚体蛋白，绿色为三聚体蛋白（图片来源为Particle Sizing Systems）。

动态光散射测试粒径范围一般从0.3nm至10μm。密度较大，粒径1μm或以上的磁性微球由于在溶液中沉降速率过快，影响布朗运动，因此测试可能存在一定偏差。对于大颗粒，如磁性微球的测试，一般采用颗粒计数器进行测试。颗粒计数器一般通过测试单位时间内经过传感器的颗粒数量，及对传感器影响，进行颗粒粒径测试以及数量计数。如单颗粒光阻法传感技术，由于经过光感区域的粒子，由于大小不同，光强随之产生相应变化，将光信号转化为电信号，不同的电信号对应不同的颗粒粒径，从而得到微粒的粒径，同时还能够得到每个粒径下面颗粒的数量信息。如采用单颗粒光阻法的PSS仪器AccuSizer780，配合不同型号传感器，能够测试的粒径范围从0.5μm至5000μm，粒径分辨率达到0.01μm，是测试亚微米、微米级颗粒的重要手段。

△单颗粒光阻法测试仪测试0.7+0.8+1.3+2+5+10+15+20+50+100+200 μm多种微球混合体的粒径分布图/来源：ParticleSizingSystems

总 结

微纳米颗粒如今以及广泛应用于体外诊断领域，如何更好的表征分析微纳米颗粒的粒径，溶液中的状态，以及分析微纳米颗粒在使用过程中的问题分析有重要作用。透射电镜适用于表征50nm以下的金纳米颗粒，2-10nm的量子点；扫描电镜适用于50nm至微米级别的颗粒表面形貌；动态光散射能够测试分析0.3nm至10μm的颗粒在溶液中的状态；单颗粒光阻法颗粒计数器能够测试0.5μm以上颗粒在溶液中的状态，以及粒径分布，颗粒数量等，能够分析颗粒在特定溶液中是否聚集。具体采用什么表征手段，则需要视具体问题而定。

Reference

[1]Talapin D V, Poznyak S K,Gaponik N P, et al. Synthesis of surface-modified colloidal semiconductornanocrystals and study of photoinduced charge separation and transport innanocrystal-polymer composites[J]. Physica E: Low-dimensional Systems andNanostructures, 2002, 14(1-2): 237-241.