使用低分辨单四极杆LC／MS对多电荷寡核苷酸进行精确质量质谱图解卷积分析

液相色谱-质谱联用仪（LC/MS）是检测mRNA疫苗和寡核苷酸的一个重要手段，其中一个典型的工作是通过质谱图中一系列多电荷离子的质荷比（m/z）和电荷数（z），来计算分子的平均分子量。

　　通常这一任务是在高分辨质谱上完成，但在某些情况下，其高昂的成本或较高的技术门槛，对一些实验室来说是一种挑战。

　　低分辨的LC/MSD四极杆质谱仪的采购成本和使用成本更低，通过在系统中增加MassWorks质谱校正软件，也可以让四极杆LC/MS像高分辨质谱那样对多电荷的大分子（如蛋白、寡核苷酸、聚合物等）进行精确质量分子量的测定。

　　实验

　　仪器：安捷伦Infinity II 1290 -6135C LC/MSD XT

　　数据分析：Cerno MassWorks软件

　　质谱条件：全扫描 700-3000 m/z，数据采集模式为Profile，采样阈值设置为零（Threshold = 0）。

　　样品：寡核苷酸标准品，信息如表1。

　　表1：寡核苷酸标准品信息

　　1. 质谱数据校正

　　在MassWorks 软件中，打开Agilent LC/MS调谐液的质谱数据（见图1），选取目标离子用于质谱图的精确质量和峰型校正。

　　图1：在MassWokrs选取LC/MS调谐液的标准离子用于质谱校正

　　标样校正结果（见图2）表明，用于校正的8个标准离子的绝对质量偏差均小于1.6mDa，相对质量误差小于2.6 ppm，谱图准确度（Spectral Accuracy）大于95%，校正结果表现很好，可以用于后续的样品数据的分析。

　　图2：质谱校正结果

　　2. 结果与讨论

　　寡核苷酸标准品在安捷伦OpenLab CDS中的原始质谱图见图3，每个质谱峰的m/z仅能测定至小数点后1位（0.1）。

　　图3：OpenLab CDS的原始质谱图

　　经MassWorks软件校正处理后的寡核苷酸质谱图如图4所示，每个质谱峰的m/z都被测定至小数点4位（0.0001）。

　　图4：经MassWorks软件校准后的精确质量质谱图

　　3. 手动质谱解卷积//分子量计算

　　分子量（MW）的计算是通过如图5所示的一系列离子的电荷数（z）及m/z，并参考图6的公式来进行。其中m1和m2是两个相邻质谱峰的m/z值，而X是加合物的质量。当比较该寡核苷酸原始质谱图和精确质量质谱图的结果时，发现经MassWorks得出的平均MW的不确定性显著降低，并且非常接近理论的MW。

　　图5：分子量MW的计算结果（左：用OpenLab CDS中的“名义质量”计算的分子量；右：用MassWorks中的精确质量计算的分子量）

　　图6：电荷数Z和分子量MW的计算公式

　　4. 未知峰的分子量测定

　　对未知峰进行了类似的计算，同时检查了较小的肩峰。共检测到了3种不同的离子并计算了它们的相对浓度。该未知峰主要为寡核苷酸的neutral形式，其含量为80.64%，其它两种离子的MW分别偏移了+22.26 Da和+38.65 Da，表明是Na+和K+加合物，结果见图7。

　　图7：未知峰的分子量测定

　　5. 多电荷离子谱图准确度模型（SAMMI）

　　由于寡核苷酸序列已知，我们可以在MassWorks软件中用SAMMI工具进行进一步的确认分析，同时我们还可以对其它的加合物或修饰物进行确证分析。如在图8的示例，SAMMI能够分配并解释全部的质谱峰，整体的谱图准确度为86.3%，并且证实了寡核苷酸质谱图中Na+和K+加合物的存在。

　　图8：SAMMI分析寡核苷酸标样的结果

　　6. 结论

　　1）在低分辨率的单四极杆LC/MSD系统上，通过MassWorks软件的适当校正获得了寡核苷酸的精确质量质谱图。

　　2）通过手动的分子量计算，比较了使用定义质量和精确质量分别计算平均分子量的结果，结果表明MassWorks的精确质量谱图极大地提高了分析可信度。

　　3）利用SAMMI工具进行的未知物分析和寡核苷酸标样的分析均证实了Na+和K+加合物的存在，且谱图准确性高。

　　关于MassWorks 软件

　　MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。

　　关于绿绵科技

　　绿绵科技是Cerno Bioscience公司在中国区的总代理商，负责Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等产品市场推广、销售、售前/售后技术支持、应用支持。

　　若您想了解获取 MassWorks 产品的更多信息或应用，欢迎致电绿绵科技！