实验材料 基因组DNA
试剂、试剂盒 PCR 混合液
仪器、耗材 96孔透明板和盖子水平离心机ABI PRISM 7700 测序系统热循环仪统计软件包
实验步骤
1.96孔透明板B到H行每孔加2ul (30ng）基因组DNA，保留A行作对照—其中4孔只加2ul缓冲液作为「无 DNA」对照，余下8孔每孔加24基因组DNA作为阳性对照，两种纯合子各加4孔。
2.每孔加23ul PCR混合液，盖上透明盖，在水平离心机上短暂离心，用ABI PRISM 7700测序仪得到一个PCR反应前荧光读数。使用「PlateRead」形式，确保选中Use Spectral Compensation forEndpoint 项（在Advanced Optionsinthe Instrument and Diagnostics菜单下）。
3.用下面的条件在热循环仪上开始PCR。
1个循环：2 min 50°C
1个循环：10min 95°C(变性）
40个循环：15s 94°C(变性)
1 min 62°C(复性/延伸)
最终步骤：无限4°C(维持）
4.再次读取荧光得到一个PCR反应后读数。如果使用ABI PRISM 7700提供的等位基因分析（allele-calling)软件，选用「AUelicDiscrimination」模式读取焚光，通过算法可以自动分出基因型或通过视觉检查进行基因分型。
如果进行大规模基因分型（如样本数>500)，将多个孔板的样本数据集中起来确定基因型显得更为准确。这样，请遵照本方案中的剩余步骤。