假单胞菌转录调节因子AlgR通过非编码RNARsmZ调控脂肪酶LipA表达探讨

参考文献：The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5. Biochemical and Biophysical Research Communications（IF2.466）
关键技术：EMSA、基因敲除CRISPR-Cas9、lacZ报告基因假单胞菌转录调节因子AlgR通过非编码RNA RsmZ调控脂肪酶LipA表达机制探讨　　脂肪酶（Lipase）是一种存在于动物、植物、微生物中的工业用酶，广泛应用于食品、去垢剂、生物质能等领域。目前商品化的脂肪酶主要来源于微生物，但传统的育种、培养基营养优化的手段在提高其产量方面面临瓶颈，亟待从分子机制层面寻找解决途径。　　目前研究证实细菌中脂肪酶的表达受到双组份调控体系如LipQ-LipR调节，但假单胞菌P. protegens Pf-5菌株的分子调控机制有待深入研究，AlgR作为转录调控因子在假单胞菌P. protegens Pf-5菌株中对于脂肪酶产量控制关系及机理此前还未见报道，同时已知AlgR也能够调节ncRNA RsmZ，故而本文采取基因敲除、lacZ报告基因、EMSA等方法研究AlgR对于lipA的表达调控机制。
研究内容及结果1. 证实AlgR在转录水平控制lipA表达　　构建了algR敲除的Pf-5菌株（名为Pf6003），培养测定其生长曲线，并检测对比敲除菌株中lipA酶活性。结果显示野生型、algR敲除型Pf-5菌株的呈现一致生长曲线，说明algR的敲除不影响Pf-5的生长（图A），但是敲除株的总脂肪酶活性显著下降（图B）。 　　此外将lipA的启动子连接lacZ报告基因、将报告基因质粒分别转入野生型及突变型Pf-5菌株，后续检测β半乳糖苷酶（b-galactosidase）活性，发现在敲除突变株中b半乳糖苷酶活性低于野生型（图C）。通过RT-PCR检测lipA的mRNA表达，显示突变株中lipA mRNA水平降低（图D）。 
　　同时通过lacZ报告基因实验显示algR的补偿过表达在野生型和缺失突变型Pf-5中都能提高β半乳糖苷酶活性及lipA酶活性。　 
2. AlgR影响rsmX/rsmY/rsmZ的表达　　使用RT-PCR实验证实在Pf-5菌株中敲除AlgR基因后，rsmX/rsmY/rsmZ的转录水平均上调。 
3. AlgR直接结合于rsmZ启动子序列　　本文表达纯化了AlgR蛋白、合成了rsmX/rsmY/rsmZ启动子序列的探针，进行EMSA实验验证AlgR蛋白同这些基因启动子序列的互作关系，证实AlgR蛋白存在直接相互作用、而AlgR蛋白不能结合于rsmX/rsmY的启动子序列。 
5. AlgR通过rsmZ调节lipA的表达　　构建了rsmZ敲除的Pf-5菌株（名为Pf6285），并构建了同时双敲除algR和rsmZ的Pf-5菌株（名为Pf6100），通过lazZ报告基因及酶活力测定显示，同时敲除algR和rsmZ基因的Pf6100中lipA表达及总酶活性显著低于algR单独敲除的菌株，而在algR单独敲除株中过表达rsmZ能够使lipA酶表达及活性恢复到野生型水平。 总结　　构建了分别单独敲除algR或rsmZ的假单胞菌株Pf-5，及同时敲除algR和rsmZ的菌株，通过lacZ报告基因系统以及细胞总酶活力测定，证实了algR的缺失突变导致lipA水平下降，同时rsmZ的过表达能够补偿algR缺失对于lipA的下调效应，并通过EMSA实验验证了AlgR蛋白能直接结合于rsmZ的启动子序列，说明algR基因是通过rsmZ来调控假单胞菌株Pf-5中lipA的表达水平。
　　本文采取基因敲除Cas9、lacZ报告基因、EMSA等方法研究AlgR对于lipA的表达调控机制，在表观遗传调控、非编码RNA、蛋白互作等的应用极其成熟，可@qq3268908524索取文献全文及服务沟通......