Science：有比CRISPRCas更安全的技术吗？基于retroelement的基因组编辑工具

　　在一篇展望文章中，Stephen Tang和Samuel Sternberg讨论了基于retroelement的基因编辑作为CRISPR-Cas方法的一种更安全的替代方法。

　　精确的基因组编辑技术改变了现代生物学。可编程DNA靶向的能力已经迅速提高，这主要是由于细菌RNA引导的CRISPR-Cas系统的发展，这种方法允许精确切割目标DNA序列。然而，CRISPR-Cas9系统会产生DNA双链断裂(DSB)，激活细胞DNA修复途径，从而导致不需要的复杂副产物，包括大的染色体缺失和易位，从而导致安全性问题。

　　不过越来越多的研究表明，利用可移动遗传元件，特别是逆转录元件，可以作为CRISPR-Cas系统的替代方案。在这篇最新文章中，研究人员指出逆转录因子是靶向基因组工程的潜在有用工具，因为它们是内源性DNA片段，使用宿主的RNA聚合酶产生自身的RNA副本，然后通过逆转录因子编码的逆转录酶将其转化为互补DNA (cDNA)。

　　之后通过一系列不需要DSB的机制将该cDNA产物整合到基因组中。最近对逆转录元件编码的蛋白质-RNA复合物的结构和功能的研究已经开始解决这些能力背后机制的分子细节，“揭示了重新设计它们用于可编程DNA插入的令人兴奋的机会，”作者写道。

　　移动遗传因子（MGEs）存在于所有生物体中，它们编码的酶可促进自身 DNA 在基因组内和基因组间的移动。MGEs 有两大类：DNA 转座子和逆转录子，可根据其扩散机制加以区分。DNA 转座子通常编码转座酶，通过将序列从其原始位置切除并整合到目标基因座（"剪切-粘贴"）来移动 DNA。相比之下，逆转录酶依赖宿主细胞的 RNA 聚合酶来生成该元件的 RNA 副本，然后将其作为模板，由逆转录酶编码的逆转录酶（RT）合成互补 DNA（cDNA）。然后，这种 cDNA 产物通过一系列机制被整合到基因组中，形成原始 DNA 片段的新拷贝（"复制粘贴"）。

　　MGEs 是基因组编辑应用的天然候选者。它们无处不在，反映了安全高效地将 DNA 整合到宿主基因组的微调能力。然而，MGEs 通常对整合位点表现出随机或固定的特异性，这限制了它们在可编程 DNA 插入方面的用途。这与基于 CRISPR 的基因组编辑不同，Cas9 核酸酶可由用户定义的引导 RNA（gRNA）引导，以几乎任何感兴趣的 DNA 序列为目标。

　　但在传统的 Cas9 基因组编辑中，DNA 靶向和编辑是两个独立的过程： Cas9 能识别并切割靶序列，产生 DNA 双链断裂（DSB），激活细胞 DNA 修复途径，对序列进行永久性编辑。这一过程会引入大量异质性，并可能导致不必要的副产品，如染色体大缺失和易位，从而引起对产生 DSB 的基因组编辑方法安全性的担忧。

　　因此，CRISPR-Cas 系统和 MGEs 在靶位点特异性和遗传毒性方面表现出互补的优缺点。理想的基因组工程工具应融合两者的能力，直接将可编程 DNA 靶向与目标位点的无 DSB 修饰结合起来。

　　20 多年来，Retroelements一直是基因组工程工具包的一部分，但直到最近，它们在定向 DNA 插入方面的作用还很有限。例如，targetrons 是经过修饰的细菌 II 组内含子，通过与内含子 RNA 的碱基配对相互作用，将用户指定的 DNA 序列归位，从而催化反向剪接到目标位点。虽然靶向子已被用于靶向基因破坏，但由于对合成货物的耐受性差，阻碍了将其用于转基因插入的工程设计。Retron是最近加入工具包的一种细菌逆转录子，已被设计用于从RNA模板产生供体DNA，以同源定向修复CRISPR-Cas9裂解位点。然而，反转录子介导的方法只应用于小规模编辑，而且它们对产生 DSB 的依赖会给临床基因编辑带来安全风险。因此，Targetrons 和 retrons 展示了利用逆转录素进行生物技术的前景，但它们还没有达到逆转录素介导的基因组编辑工具的终极能力：将任何新的 DNA 序列直接写入任何基因组靶位点。

　　最近的两项研究利用低温电子显微镜确定了家蚕 R2 RT 与 R2 RNA 和 28S DNA 靶标结合的三维结构。这揭示了 RT-RNADNA 复合物中特定的分子相互作用，表明逆转录转座子通过 R2 蛋白的序列识别选择其 RNA 模板和 DNA 靶标。这些结构细节被用来设计合成 R2 RNA，其中包括最小识别序列和 "货物 "RNA 附属物。R2 RT 能识别这种工程底物，并能被 Cas9 改变方向，在生化反应中将货物结合到非 28S 靶序列上。

　　利用逆转录酶作为靶向基因插入工具已经奠定了坚实的基础。然而，这方面的知识仍然存在重大差距。例如，R2 RT 产生的 cDNA 的基因组整合需要合成第二条 cDNA 链，但这一过程的机制细节尚不清楚。旨在解决 R2 逆转录最后步骤的分子要求的其他研究对于 R2 在细胞中进行转基因插入工程至关重要。此外，还没有报道过系统分析 TPRT 精确性的方法。开发此类方法对于评估逆转录酶介导的基因组编辑策略的安全性至关重要。

　　自然界中存在大量的逆转录酶，但只有少数逆转录酶的基因组编辑潜力得到了研究。某些具有未知特性的 RT 酶可能天生就非常适合基因组编辑任务。通过生物信息学分析和集合筛选对逆转录酶多样性进行系统挖掘，对于鉴定具有理想特性的 RT 酶将是非常宝贵的。这种策略已经在开发紧凑型素编辑器方面取得了成果。还值得注意的是，逆源因子在人类基因组的形成过程中已经发挥了巨大作用，其中大约一半来自 MGEs。因此，在开发基于逆源因子的 DNA 编辑工具时，人类正在重新利用自然界最初的基因组工程师。