光镜下细胞大小的测量与计数

一、实验目的

1.学会观察某些细胞形态，掌握显微镜使用方法。

2.掌握测量和计算细胞大小的方法。

3.掌握台尺，目尺的使用方法，知道细胞度量单位。

4.掌握血球计数板的使用方法

二、实验原理

（一）显微测微尺

显微测微尺分物镜测微尺和目镜测微尺，目镜测微尺为一块可以放入目镜内的圆形玻片，玻片中央有一长5-10mm的刻度尺，分成50-100格。每格的实际长度随不同的物镜放大倍数而变化。物镜测微尺为一载玻片中封固一圆形测微尺组成，测微尺的长度为1-2mm，分成 100或200格，每格实际长度0.01mm。当测量细胞大小时，须在显微镜下用物镜测微尺核实目镜测微尺的每一格长度，然后再用目镜测微尺去测定标本。

换算公式：目尺每格长度（mm）= 物尺的格数/目尺的格数×10㎛

（二）血球记数板

现在使用的记数板为改良Neubauer记数板，由一优质厚玻璃制成，每块记数板分为两个记数室。在记数室两侧各有一条支柱，与记数室高度差是0.1mm，当一块平整的记数用盖玻片放到两条支柱上时，盖玻片底面与记数室间形成0.1m的缝隙。每个记数室的边长各为 3mm，并被精密地划分为9个大方格，每个大方格长宽各为1.0mm，面积为1mm²，加盖玻片后的容积为1mm² ☓ 0.1mm=0.1mm³（相当于0.1㎕），所以一个大方格的细胞数×104=细胞数/ml。记数细胞时，记数四个大方格中的细胞数，按下公式计算：

细胞悬液的细胞数/ml=(四个大方格中的细胞总数/4) × 104

三、实验器材、药品

普通光学显微镜，微分尺（目尺和台尺），血球计数板，洋葱内表皮细胞,小鼠脾细胞等。

四、实验步骤

（一）在光学显微镜下测量细胞大小：

1.卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度一面向下装在目镜镜面上，再旋上目镜的上透镜。

2.将镜台测微尺有刻度一面朝上放在载物台上夹好，用低倍镜观察，调焦至看清镜台测微尺的刻度。

3.小心移动镜台测微尺，同时转动目镜(如目镜测微尺刻度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使目镜测微尺与镜台测微尺平行靠近，两尺左边的\"0\"点一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重复的直线。

4.记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按公式计算目镜测微尺每格的长度等于多少mm。

5.拿开台尺，放上细胞标本片，开始测量，按上述公式计算。

（二）细胞计数

（1）准备计数板：用去离子水浸泡并冲洗计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干或晾干。

（2）制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。本法要求细胞密度不低于 104细胞/ml,若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm，2min），重悬浮于少量培养液中。

（3）加样：用吸管轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。

（4）计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。

（5）计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度（4大格中的每一大格体积为0.1mm3。 1ml=l，0000大格，因此，1大格细胞数×104=细胞数／ml）

细胞数/毫升原液=（4大方格细胞数之和/4）×104

注意事项：

（1）消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。

（2）取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时，尤应注意这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。

（3）镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占10%以上，说明消化不充分；或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当，需重制备细胞悬液、计数。