克隆中载体的处理和去磷酸化

克隆成功与否,除与连接方式以及载体选择有关外,载体的处理也是一个重要环节。为了提高连接效率,处理载体时应注意以下几点:

(1)应加入常用量5~10倍的内切酶水解载体,以保证载体被完全酶切;

(2)如用双酶切割载体,则必须电泳回收载体片段,除去双酶切所产生的小DNA片段;�(3)如粘端连接,单酶切处理过的载体必须用

碱性磷酸酶

(如牛小肠碱性磷酸酶,CIP)处理,防止载体自身环化。

CIP

可以水解掉DNA5末端的磷酸。对于3末端突出的DNA(如

〖WT5BX〗Pst〖WT5BZ〗I水解,需用10倍于5末端突出DNA(如〖WT5BX〗Eco〖WT5BZ〗RI,〖WT5BX〗

Hin〖WT5BZ〗dⅢ)的CIP进行去磷酸化,以达到最少的载体自身环化。

去磷酸方法如下:

①DNA加入10倍去磷酸化缓冲液,5端突出的DNA,每100pmol 5�磷酸基团加入1个单位的CIP,37℃反应30分钟。平末端或3端突出的DNA,每2pmol 5�磷酸基团加1个单位CIP,37℃保温15分钟后,再加CIP,55℃反应45分钟(2μg 5kb的线性DNA约含14pmol左右的5磷酸基团);

②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分别至终浓度05%、5mmol/L和50μg/ml,混匀后56℃反应30分钟;或加EDTA(pH8.0)至终浓度为5mmol/L,65℃保温1小时或75℃,10分钟灭活CIP;

③冷却至室温后,加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次;

④乙醇沉淀,离心,抽干,溶于无菌去离子水,浓度最好为100μg/ml,-20℃保存备用。〖HT5H〗 10倍CIP去磷酸化缓冲液:

〖HT〗〖JZ(Z〗10 mmol/L ZnCl�210 mmol/L MgCl 2100 mmol/L Tris·HCl,pH8.0。