克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定

热稳定 DNA 聚合酶 正义和反向引物 DNA 模板

扩增缓冲液 dNTP 贮存液 Tris-Cl

琼脂糖凝胶 屏蔽型枪头 沸水浴 离心管 正向排液式移液器 PCR 仪

一、材料

1. 缓冲液与溶液

10X 扩增缓冲液

4 种 dNTP 贮存液（20 mmol/L，pH 8.0)

Tris-Cl ( 10 mmol/L，pH 7.6)

2. 酶与缓冲液

热稳定 DNA 聚合酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶

4. 核苷酸与寡核苷酸

正义和反向引物（20 μmol/L) 溶于水中（20 pmol/μl）

DNA 模板

5. 特殊设备

自动微量移液器的屏蔽型枪头

沸水浴

离心管

正向排液式移液器

PCR 仪

二、方法

筛选单个克隆的细菌菌落或 λ 噬菌斑

1. 对所要筛选的细菌菌落或 λ 噬菌斑进行计数。制备适量的主混合液，每个所要分析的菌落或噬菌斑需要 25 μl 的主混合液，以此主混合液作为模板 DNA，再加入以下试剂，使总体积为 1 ml：

10X 扩增缓冲液                     100 μl

20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液  50 μl

正向引物                               1 nmol

反向引物                               1 nmol

H₂O 补足至                           1 ml

2. 从上述主混合液中取 25 μl 至一支扩增离心管（根据实验需要可设几个扩增管 )。

3. 用灭菌的 20 μl 枪头（不用牙签）挑取一个个的细菌菌落或 λ 噬菌斑，迅速地使挑取物溶在 25 μl 主混合液中。

4. 盖上离心管的盖子，细菌菌落在沸水上温育 10 min，λ 噬菌体在沸水中温育 2 min。

5. 在样品管主混合液于沸水上温育的同时，将 Tag 聚合酶用 10 mmol/L Tris ( pH 7.6）稀释至 1 单位/μl；再将这种稀释酶液在冰浴上保存备用。

6. 将步骤 4 的样品冷却至室温，离心数秒钟，然后每一管加入 1 μl 稀释的 Taq DNA 聚合酶。

7. 设置两支对照管。在一支对照管中加入除了模板 DNA 的所有上述试剂；在另一支对照管设置呈阳性对照管，即加入已分析证实呈阳性的重组 λ 噬菌斑或菌落裂解液作为模板 DNA。阳性对照管的扩增片段应较实验管的扩增片段更大些为佳。这种较大的阳性对照片段的成功扩增，说明这种稳定 DNA 聚合酶具有扩增多大长度片段的能力。

8. 如果 PCR 仪没有配备加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油（约 50 μl )。将反应管放置 PCR 仪上。典型的程序有变性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：



9. 抽取每种扩增样品 5~10 μl，用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果，用 DNA marker 来判断扩增片段的大小。凝胶一般用 EB ( 溴化乙锭） 或 SYBR 金颗粒染色后来观察扩增的量与片段大小。

这种技术能够适用于在 96 孔微量滴定板上设计 PCR 进行大量的细菌菌落或 M13 噬菌斑的筛选（Trower 1996)。