免疫学细胞因子的定量检测，Elispot酶联斑点分析技术六

6.        取出封闭2h的ELISPOT板，吸弃每孔中的封闭液。(不要洗板！) 
7.        在ELISPOT板中，先加30μl 无血清培养基(12道排枪)和20μl肽库(8道排枪)，后加50μl细胞(8道排枪) (每孔活细胞总数为2×105，每个病人需活细胞总数为10×106，体积为2.5 ml。每条多肽的终浓度为5μg/ml，活细胞的工作浓度为4×106/ml，活细胞的终浓度为2×106/ml）。 
阳性孔中每孔加入50μl 细胞和30μl无血清培养基和20μl PMA+Inomysin（工作液浓度分别为250ng/ml和5ug/ml，终浓度分别为50ng/ml和1ug/ml）。 
8.        用low evaporation lid 盖好ELISPOT板，放入37℃ CO2孵箱培养30 h。 
注意：不要晃动ELISPOT板。 

Day 4  
二抗和GABA标记，显色反应 8：30 
9.        培养30h后，取出ELISPOT板，甩去细胞后。 
10.    用去离子水洗涤2次。每次浸泡5分钟。 
11.    用0.05％PBST洗涤3次。每次浸泡2分钟。 
12.    每孔加入100μl 生物素化的detector Ab(8道排枪)。室温2小时。 
13.    取出ELISPOT板，倒去detector Ab溶液，用PBST洗涤3次。每次浸泡2分钟 
每孔加入100μl Strep-HRP溶液(8道排枪)。室温1小时 
14.    取出ELISPOT板，倒去Strep-HRP溶液。 
15.    PBST洗涤4次。每次浸泡2分钟。 
16.    用PBS洗涤2次。每次浸泡2分钟。 
17.    洗涤完毕后，在吸水纸上轻轻拍干ELISPOT板。 
每块板子200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混匀，15分钟内用完。 
18.    每孔加入100 µl 配好的substrate(8道排枪)。在暗处、室温下孵育（5～60分钟）。 
出现斑点后，用自来水冲洗，中止反应。室温下干燥，检测。