免疫纯化实验

制备免疫亲和柱要求抗体首先共价结合到介质上。另一方法是将抗体结合到蛋白 A 或 G 小珠上，再用交联剂固相化。后一方法由于蛋白 A 或 G 结合在杭体的 Fe 区， 所以结合抗原的部位获得充分暴露，从易于接近。免疫亲和柱制备完成后，抗原溶液即可以上样，接着洗去污染物，然后洗脱抗原。如果不能利用特异的配基破坏抗原抗体之间的相互作用来洗脱，只好釆用非特异洗脱方法。但是非特异洗脱方法一定要小心应用，以免目的蛋白失活。

单克隆抗体通常在免疫亲和纯化中比多克隆抗体更有用。单抗代表与目的蛋白具有单一特异结合部位的均一抗体，因而它的结合是确定一致的。洗脱也如此，因为只需破坏单一类型的相互作用就能释放目的蛋白。应当说，多克隆抗体在亲和纯化中也是可用的，特别是用很纯的抗原免疫动物产生的多克隆抗体。总之，进行有效的免疫纯化的主要关键是获得特异抗体，它与底物之间具有 YI 一定强度的亲和结合力。该强度的结合力一方面可以在洗柱过程中保持底物蛋白仍然结合在柱上，不被洗脱；另一方面又不至于结合太紧难以洗脱，采用极端洗脱条件而造成底物蛋白变性。所以选择用于免疫纯化的抗体的方法应是试验一组单克隆抗体，挑选不仅具有足够的亲和结合力，而且还能洗脱下完整抗原的抗体。

免疫纯化的质量取决于抗体溶液的纯度。制备免疫亲和柱使用的抗体既要具有前面提到的特性，又要尽可能的纯。免疫亲和柱的制备是相当昂贵的，其结合容量却相对较低，常常每 ml 介质结合到 1 mg 抗原。因此为了节省和提高效率，经常制备的是小而粗的柱子，同时在亲和纯化步骤里要求样品溶液重复几次上样，以便纯化更多的抗原蛋白。此外，较小的柱子也可以减少和限制柱污染或蛋妇酶灭活造成的抗体丢失。

免疫沉淀也可看作另一类型的免疫和纯化。还有一个类型是反向免疫纯化，它利用抗体柱除去溶液中特异的污染物一抗原。

抗原

PBS HCl NaN3

离心机

1. 5～10 倍柱体积的起始缓冲液，如磷酸缓冲盐液（PBS）洗柱；

2. 3～5 倍柱体积的冼脱缓冲液，如 0.1 mol/L，pH 2.5 glycine-HCl 洗去污染物；

3. 5～10 倍柱体积的起始缓冲液平衡柱；

4. 通过透析、凝胶过滤、加 1/10 体积 10× 起姶缓冲液至样品液等方法用起姶缓冲液平衡样品。样品需事先 100 000×g，离心 30 min 或经 0.22 um 滤膜过滤处理；

5. 上样到柱子。上样时较慢的流速可以获得更好的抗原结合。样品应循环重复上样几次；

6. 5～10 倍体积起姶缓冲液洗柱，或用该液洗至 A₂₈₀ 值达到基线或本底水平。若抗原抗体相互作用较强，起始缓冲液内可含一定浓度的盐，如 0.5 mol/L KCl 以减少非特异结合；

7. 2 倍体积洗脱缓冲液，如 0.1 mol/L，pH 2.5 glycine-HCl， 洗柱，以 1 ml 为单位分部收集洗脱液。每个收集试管预先加入 0.1 ml，1 mol/L，pH 8.0 Tris-HCl 立即中和洗脱液的低 pH；

8. 检测各组分，合并活性组分；

9. 如果抗原的稳定性有限需要立即更换缓冲液，则通过透析或凝胶过滤完成；

10. 10 倍体积 0.2mol/L，pH2.5 glycine-HCl，洗柱，然后用 10～20 倍体积 PBS 洗柱，要储存时用含 0.02％ NaN₃ 的 PBS 洗柱。

配基在使用的缓冲液 pH 条件中应是稳定的。不要让柱内溶液流干。所有溶液都故经过 0.22 um 滤膜过滤除菌，以获得最大柱寿命。介质的抗原结合容量测定，可在试管内进行。该试验是在一组试管中加入恒定量的抗体介质及递增的抗原，混合后测定。