全基因组突变新技术原理简介

人类遗传图谱中，基因只占了全部DNA的2.5％，基因与基因之间的“非编码”大片段并不全是“垃圾”，有些能够调节基因的开启和关闭，有些负责DNA折叠和将DNA打包运往细胞核。不止基因突变，控制基因的DNA发生突变也可能导致疾病。小鼠是疾病研究的常用模型，想要弄清小鼠基因组中每个DNA片段的功能，需要依次敲除DNA片段，通过观察敲除结果推测所敲除片段的功能。最近，犹他州立大学研究人员发明出一种快速、廉价的突变方法，能够使非基因的DNA大片段发生突变。详细内容刊登于本周在线版《Nature Genetics》杂志。

研究人员在文章中报道说：

（1）他们发现一种敲除或复制适度长至非常长的DNA片段的方法，突变频率比其它方法的突变频率高。操作人员能够轻易找到这些突变所引发的疾病，弄清发生突变的DNA的功能。（2）他们设计出一个有效的混合和重组两条染色体片段的方法，使培养带有人类癌症的小鼠变得更容易。

基因敲除技术现在已经非常成熟，能够以给定方式敲除任何基因，但成本高、工期长。新方法不仅能够敲除基因，而且能够敲除基因之间的负责调节基因的DNA序列，成本低廉。犹他大学Mario Capecchi教授说，使用现有技术获得一种基因或其它DNA序列发生突变的遗传工程小鼠约花费1万美元，因此预测小鼠2万个基因的功能需要2亿美元，依次突变小鼠大约30万个非基因DNA序列需要30亿美元。新方法突变DNA既快速又低廉，获得带有一个突变基因或其它DNA序列突变的工程小鼠只需 200美元，这将加速美国国立健康研究所突变所有小鼠基因的工作。

新技术的原理是：采用小的DNA片段——loxP。loxP片段好似路标，在说：“切断两个路标之间的DNA。”新方法中，研究人员将loxP插入到一只小鼠的一条染色体和另一只小鼠同一染色体的不同位点，并且第二只小鼠的细胞中还插有Cre基因。子代小鼠除了具有 Cre基因外，同一染色体上还有两个loxP DNA位点。Cre基因编码的蛋白如同一把刀，将loxP之间的DNA切除。子代小鼠继续与正常小鼠交配，大约10％的子二代小鼠中，预计切除的DNA片段或者消失或者重复，因此可通过观察这些突变小鼠的异常情况，探索目的DNA片段的功能。

Capecchi说，这种方法还可使两条染色体断裂、重组，新生染色体含有两条旧染色体的一部分。此“置换”过程还可将两个基因组装为新的基因。
许多癌症都是从置换开始的。用现有方法完成两条染色体的置换，成功率为1/10,000,000-1/1,000,000，而新方法的成功率为1/100，速度提高了1－10万倍。这一点很重要，因为使小鼠患上人类癌症需要多个分子步骤，许多癌症中，两条染色体置换是第一步，如果发生率只有百万分之一，没有足够的细胞用于后继实验。

在“跳跃基因”的帮助下产生多重突变DNA

Wu和Capecchi对新方法做了进一步改进：通过引入转位子piggyBac，利用piggyBac将loxP DNA随意插入小鼠基因组中多个位点，小鼠与携带Cre基因的小鼠交配，任意两个loxP基因之间的DNA大片段都可发生突变。小鼠全基因组测序工作已经完成，研究人员可以识别携带loxP DNA的跳跃基因的位点，选择目的发生突变的DNA大片段两端都有loxP的小鼠。如果携带loxP的跳跃基因跳跃到基因的中间，该基因突变。因此该方法既能够敲除非基因DNA 大片段，也能轻易破坏基因。

Wu和Capecchi证明，利用跳跃基因突变骨形成相关基因，导致突变小鼠四肢和尾异常短小。左图为突变小鼠的骨骼，右图为正常小鼠骨骼。