全血RNA提取实验

鲜血液

抗凝剂 红细胞裂解液RLB 去蛋白液RW1 乙醇 漂洗液RW

制冰机 离心机 离心管 移液枪 移液管 针头 注射器 水浴锅

一、在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（<1.5 ml）加入各种抗凝剂新鲜血液 (颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB，颠倒混匀，可轻弹管壁，确保混匀。
 

二、室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。
 

如果RNA降解严重，可在冰上裂解，但是时间可长一些以充分裂解。
 

三、12 000 rpm离心20秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团。
 

离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤二、三。
 

上清尽可能的吸弃，残留过多会稀释裂解液，造成裂解结合异常，产量纯度降低。
 

四、涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬，加入350 ul（<0.5 ml全血）或者600 ul（0.5-1.5ml全血）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。病人血样中白细胞数量可能大幅增加，应该适当减少处理量。或者按照350 ul（<2x10⁶白细胞）或者600 ul（2x10⁶-1x10⁷白细胞）比例加RTL。
 

五、用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9 mm针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
 

六、较精确估计裂解物体积，加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
 

七、立刻将混合物(每次小于700 ul，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13 000 rpm离心60秒，弃掉废液。
 

八、加700 ul 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12 000rpm 离心30秒，弃掉废液。
 

如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
 

九、加入500 ul漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500 ul漂洗液RW，重复一遍。
 

十、将吸附柱RA放回空收集管中，13 000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
 

十一、取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50 ul RNase freewater（事先在 70-80℃水浴中加热效果更好）， 室温放置1分钟，12 000 rpm 离心1分钟。
 

十二、如果提取全血>0.5 ml或者>2x10⁶白细胞，加30-50 ul RNase free water重复步骤十一，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
 

洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15-30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。

1.   第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇。
 

2.  使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。
 

3.  操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10 ul β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。

1.   第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇。
 

2.  使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。
 

3.  操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10 ul β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。