先天代谢障碍种类繁多，诊断比较困难，最后的确诊有赖于特异性实验室检查。临床表现可以提供一些诊断探索，分析患者病程及发病特点，病史、体格检查、家系谱可作出初步诊断，再选择进行相应的实验室检查，就可能明确诊断。例如：在新生儿期出现危重的代谢异常，尤其是酸中毒，并伴呕吐、哺乳困难，就可能是糖代谢异常。患者的特殊气味也可能有诊断意义，因为在体内累积的代谢产物有些可以由尿、汗排出，而有些代谢物则有特殊气味；鼠尿味可见于苯丙酮酸尿症；烧焦的糖味见于枫糖尿症；汗脚臭味见于异戊酸血症及其他一些有机酸代谢病；啤酒花味见于氨酸吸收不良症等皮肤和毛发的异常往往也提示了重要的诊断线索；皮肤色素增多见于肾上腺脑白质营养不良，皮肤及毛发色浅见于苯丙酮酸尿症或白化病，毛发脆易折见于先天性铜代谢异常（门克斯氏病）等。
先天代谢障碍的实验室检查一般可分两步进行。第一步是用较简单的方法进行筛查，若得阳性结果再进行特异性生物化学检查，前者可在一般医院的化验室进行，后者则往往必须在专门的医学实验室才能完成。
新生儿筛查是先天代谢障碍诊断的一个重要方面，但只用于那些在临床症状出现之前就可能出现生物化学异常，并且这些代谢异常目前已有治疗方法，而且患者如果不进行治疗日后就会有较严重残疾的先天代谢障碍。目前应用最广的筛查方法是格思里氏细菌抑制试验，即将新生儿的血滴在特定的滤纸上，将统一直径的滤纸片放在接种有依赖某种代谢物才能生成的枯草杆菌株的培养基上，凭滤纸片周围细菌生长的宽度对滤纸片中含有此种代谢物的量作出大致估计。这种方法选用不同的枯草杆菌变异株，可用于诊断苯酮酸症，枫糖尿症、组氨酸血症、蛋氨酸血症等多种氨基酸代谢异常以及半乳糖血症等其他先天代谢障碍。此外，先天性甲状腺功能低下和先天性生物素基酸缺陷也已在世界各地和中国一些地区开展了新生儿筛查，这两种疾病一旦在新生儿期得到诊断,可分别给予口服甲状腺素或生物素,能有效地防止日后出现智力低下及其他症状。
先天性代谢障碍的另一类诊断内容是异常基因携带者的检出，因为绝大多数先天代谢障碍属常染色体隐性遗传，有一部分人体内有一个异常基因，虽然本人未患病，但与人群中其他带有同种异常基因的杂合子婚配后，子女中却有25%的可能患病，所以杂合子的检出有很大意义。一般必须进行代谢物或酶活性的特异性检查，方法比较复杂，目前可以进行此项检查的先天代谢障碍已达数十种。