关于动物乳腺生物反应器的发展简史介绍

　　转基因动物的研究始于20世纪80年代初。1980年，Gordon等将重组DNA用显微注射法导入小鼠受精卵原核，首次获得了整合有外源基因的小鼠。1982年，Palmiter等将大鼠生长激素基因显微注射到小鼠受精卵中，首次获得了体重为正常小鼠2 倍以上的“超级小鼠”并提出了从转基因动物中提取药物蛋白的设想。此后几年的许多研究奠定了转基因动物技术体系的基础，但真正的乳腺生物反应器研究则始于1987 年Gordon 等的工作，他们将组织型纤溶酶原激活剂（tPA）与小鼠乳清酸蛋白（WAP）基因的启动子构成重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达tPA 的转基因小鼠，同年，世界上第一只能从乳汁中分泌α1-抗胰蛋白酶（AAT）的转基因绵羊在英国罗斯林研究所诞生。从此，开始了乳腺生物反应器的实用性研究。

　　Simons等（Simons等，1987年）将带MT启动子的β-乳球蛋白-凝血因子IX（BLG-FIX）、BLG-AAT 等重组DNA片段注射到绵羊受精卵中，获得了在乳汁中有外源基因表达的转基因后代。Wilmut等将羊乳球蛋白基因片段与F-IX和AAT-cDNA 融合质粒注入小鼠及绵羊受精卵中，获得乳汁中含F-IX 和AAT 的转基因小鼠及绵羊。Wright等将绵羊BLG基因调控区与人AAT基因相连，获得了 4 只转基因绵羊。Velander 等利用WAP 基因启动子与人蛋白质C（hPC）cDNA 重组基因获得的转基因猪，重组hPC的表达量（1g/L）比人血中hPC

　　浓度还高200倍。Ebert等用β-CA基因的启动子引导tPA在山羊乳汁中得到表达（1-3g/L）。Wilmut等（Wilmut等，1997年）首创体细胞克隆技术并成功构建了表达人F-IX的转基因克隆绵羊。2000年，英国PPL 公司将人类AAT 基因定点整合到胎儿成纤维细胞的前胶原基因座，用转基因细胞生产的转基因打靶绵羊（McCreath等；2000年）；2001年，他们又利用基因打靶技术生产出了AAT、3-GT 和朊病毒双剔除的克隆绵羊。上述研究可以看出，乳腺生物反应器研究从模式动物——小鼠的转基因开始，逐步建立起了大动物乳腺生物反应器制备的技术平台。

　　我国的施履吉院士在20世纪80年代初就提出了乳腺生物反应器的构想并获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔。1996 年10 月，复旦大学遗传所和上海医学遗传所合作成功地获得了表达有活性的F-IX蛋白的转基因小鼠和5只转基因绵羊，真正开始了我国的乳腺反应器构建工作。1998年，上海医学遗传研究所构建成以牛酪蛋白基因启动子驱动F-IX基因表达的表达载体，显微注射到山羊受精卵的雄原核，成功制备了5头转基因羊。上海医学遗传研究所于1999年2月，得到一头带有人血清白蛋白基因的转基因牛。2000年，中国农大和北京兴源生物科技中心合作，将改造的人AAT 基因显微注射到山羊受精卵原核中，获得了3只带有人AAT 的转基因山羊。2005年青岛森淼公司与中科院遗传与发育生物学研究所等科研院所联合开展，选用崂山奶山羊完成了人的乙肝表面抗原、抗凝血酶AT-Ⅲ、人β-干扰素等三种转基因载体的构建，并完成了羊胎儿成纤维细胞株的建立，应用细胞核移植技术成功获得了克隆奶山羊。成功报道仍限于显微注射等常规方法，离国外尚有一定差距。