关于聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的制备和电泳介绍

　　一、凝胶的制备和电泳

　　由于氧能抑制丙烯酰胺的聚合反应，灌制聚丙烯酰胺凝胶常在两块封闭的玻璃平板所形成的夹层间进行。在这种装置形式下，仅有顶层的凝胶与空气中的氧气相接触，从而大大减少了氧对聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳一般采用垂直装置。

　　二、凝胶的制备和电泳操作如下：

　　(1) 配制试剂

　　① 30%丙烯酰胺：100ml双蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺。

　　② 5×TBE

　　每升溶液含54g Tris.HCl，27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。

　　③ 10%过硫酸铵：10ml双蒸水中含1g过硫酸铵。

　　(2) 装置胶模

　　将玻璃板和垫条事先用去污剂刷洗，并经自来水和无离子水冲洗干净，晾干。装置时，将较大的玻璃板平放在工作台上，将两个垫条放在玻璃板两侧，涂上少量凡士林，并将上层玻璃板置于垫条上，用夹子将玻板连同垫条夹紧，底部用1%琼脂糖密封。为防止漏胶，除放梳子一边外，其余三边应用防水胶带密封。

　　(3) 根据玻璃板大小及夹层厚薄计算所需凝胶溶液量，按下表配制溶液(100ml)。

　　将35μl TEMED加入100ml混合液中，混匀，然后均匀连续注入两玻璃板空隙中。

　　(4) 立即插入电泳梳，勿使梳齿下形成气泡。

　　(5) 室温聚合1小时，梳齿下出现折光带时，表明聚合反应已经完成。若凝胶不立即使用，可用纱布或滤纸(用1×TBE浸泡)包盖于凝胶顶部，置4℃保存1-2天。

　　(6) 拔去梳子，立即用水冲洗加样孔。

　　(7) 除去底部胶带，将凝胶直立放入电泳槽。在上下两槽中灌好1×TBE溶液，驱尽凝胶底部附着的气泡。并用1×TBE溶液冲洗加样孔；

　　(8) 将核酸样品与适量6×凝胶加样缓冲液(见表2-28)混合，并加入凝胶加样孔中；

　　(9) 接通电源，正极与下槽连接。电压一般控制在1.8v/cm。电压过高时凝胶产生的热量可造成DNA区带弯曲，甚至引起小DNA片段的解链；

　　(10) 电泳毕，取下玻板和凝胶，放在工作台上，从夹层一角轻撬，将上面的玻板轻轻移开，并小心揭下凝胶，置染色液中染色并进行结果观察。