关于血清脂蛋白分离的一些建议

1.      NaBr 梯度液的配置：

●  必须用极干燥的分析纯NaBr。NaBr晶体使用前在210℃烘箱中过夜，取出后储存在干燥器中

●  配置密度：1.006g /ml，9g/l

             1.016g /ml，27g/l

             1.063g /ml，95g/l

             1.210g /ml，283.4g/l

             1.368g /ml，524.8g/l

● 配置NaBr用溶剂0.05％EDTA（PH7.0），使用前EDTA必须过滤，储存在褐色瓶中，4℃，使用前要析测密度（用阿贝折射仪或其他恒温折射仪（浓度－密度配置表见后）

2.      分离步骤：

Ⅰ. 去除血细胞：1000xg，20分

Ⅱ. 去除乳糜粒（见技术讲座文献）

Ⅲ. 用血清/1.386g/m溶液=1:4的比例混合分离用样品液

（例：P40ST水平转头用0.2ml血清加0.8ml 1.386g/ml，NaBr液；P35ZT区带离心转头用200ml血清加800ml 1.386g/ml NaBr液）

Ⅳ. 梯度铺设：如果用13ml离心管，则底部加1ml混合样品液，然后依次向上分层铺设：3.2ml，1.21g/ml NaBr；3.8ml 1.063g/ml NaBr液；3.3ml，1.016g/ml NaBr液；1.2ml 1.006g/ml NaBr液。

如果用P35ZT区带转头则先从转头外测从低密度到高密度依次加入1.006，1.016，1.063，1.21梯度液最后加入样品混合液，参考容量依次为74ml，193ml，228ml，195ml及1000ml。

3.      离心工艺：

● P40ST转头：38,500rpm（263,000xg），24hrs，14℃，加速“8”，减速“7”

● P35ZT区带转头：35,000rpm（122,000xg），49hrs，14℃

4.      样品收集：

● P40ST转头：离心后可以用手工收集也可以用日立DGF－U（密度梯度制备－收集仪），手工收集每管（13ml）收集或40管，分别测O.D.值（280mm及260mm）绘出O.D.－管数值曲线。根据各峰顶对应位置可以找到各种密度脂蛋白所在管。

用DGF－U收集时将抽出管联接到带流动池的分光光度计，流动池连续测量O.D.，并在记录仪上绘出O.D.－管数的连续曲线。再根据O.D.峰对应位置找到各种密度脂蛋白所在管。

●  P35ZT转头：用Masterflex管道泵将40％w/w NaBr液体从转头外测连续泵入转头，中心管接到分光光度计流动池，从中心管排出的样品连续测定O.D.，并在记录仪上绘出O.D.－管数曲线，一般根据需要可以收集成50－100管，和P40ST同样方法决定各种不同密度脂蛋白所在管。

5. 结果：用P40ST转头分离纯化收集后各种密度脂蛋白分布如下：

用P35ZT分离的结果可根据峰位置决定管序数

6. 讨论：可分别测A260与A280，根据A280/A260比值可估计蛋白质纯度，如果某个峰值A280/A260≈1.8，说明蛋白质较纯。