痰及分泌物的细菌学检查（包括涂片、培养及菌型鉴定）是确诊的主要依据。在被诊断为肺结核、淋巴结核的病人中，对抗结核药物呈原发耐药者，对那些病程迁延、虽经合理积极抗结核药物治疗而疗效不显著者，以及痰菌持续阳性者，应疑及本病。
主要应与结核病鉴别。其鉴别要点为：
①病情迁延，对抗结核药物治疗效果差。因为非典型分枝杆菌对常用的抗结核药物如链毒素、异烟肼等均不敏感，而对利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、环丝氨酸、乙硫异烟胺的敏感性则因菌种不同而有所差异，因此治疗失败率明显高于结核病。
②皮肤试验。非典型分枝杆菌病患者对O.T.（旧结核菌素）或PPD（结核菌素纯蛋白衍生物）的皮肤试验常呈弱阳性反应，而对本型的PPD反应较强。但是结核菌与非典型分枝杆菌间具有多种共同抗原或抗原决定簇，故常有交叉反应，因此对其诊断价值评论不一，有赖于各菌种特异性纯化抗原的分离、制备、以提高其特异性。
③确诊的主要手段是菌型鉴定。
④选择性培养基。在含有对硝基苯甲酸的PNB培养基和含有氯化羟胺的HA培养基上，人型、牛型结核菌不能生长，而非典型分枝杆菌可以生长。
随着结核菌及非典型分枝杆菌单克