关于PCR，你知道多少？（四）TaqDNA聚合酶

在PCR反应中，毫无疑问的DNA聚合酶是最关键的因素。PCR最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶 I的Klenow片段。但该酶存在很多缺陷，使之不能广为应用，比如：热稳定性差，每次DNA热变性后大部分酶都被灭活，需要重新加入，每个循环都要重新加入；Klenow酶反应温度较低，引物和模板容易形成非特异性配对，产生非特异性扩增。后来人们曾使用过T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，两者虽使扩增特异性增加，且使DNA合成速度提高了，但是由于其对热的稳定性差而未能广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶发现，才使得PCR技术得到迅速的发展和广泛的应用。

Taq DNA 聚合酶是从一种嗜热水生菌Thermus aquaticus YT-1菌株中分离提纯得到的。是1969见从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得到的，它生长在70～75℃极富矿物质的环境中。

Taq DNA 聚合酶基因全长为2496碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子量为94KD。该酶在70～75℃时具有zui高的生物活性。75～80℃条件下每一个酶蛋白分子每秒可延伸约150个碱基。70℃时，酶分子延伸速率每秒在60个碱基以上。温度降低时，延伸速率明显下降。55℃时为每秒22个碱基，37℃时约每秒1.5个碱基，22℃时约每秒0.25个碱基。当温度超过80℃时，合成速度也明显下降，这可能和引物或引物-模板复合物的稳定性遭到破坏有关。

Taq DNA 聚合酶具有良好的热稳定性。曾有测试：在92.5℃、95℃、97.5℃下，Taq DNA 聚合酶的生物半衰期分别为130分钟、40分钟和5～6分钟。与大肠杆菌DNA聚合酶I相比较，Taq DNA 聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。因此，在PCR反应中如果发生某些氨基酸的错配，这种酶是没有修正功能的。使用Taq DNA聚合酶的PCR反应出现碱基错配的几率为2.1×10^-4左右。

和其他许多聚合酶一样，Taq DNA聚合酶是Mg²⁺依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感。以鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.7～0.8 mmol/L时，用不同浓度Mg²⁺进行PCR反应10min，测定结果为MgCl2浓度在2.0 mmol/L时该酶催化活性zui高，此浓度能zui大限度地激活Taq DNA聚合酶的活性，Mg²⁺过高就抑制酶活性，当MgCl₂浓度在10 mmol/L时可抑制40～50%的酶活性。由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离的Mg²⁺浓度，因而MgCl₂的浓度在不同的反应体系中应适当调整。一般反应中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L。另外适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶的活性。

Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子量65kD，最初由Saiki等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌（thermus aquaticus）中提取获得。此酶能耐高温，在70℃反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%；在分子克隆中Taq DNA聚合酶可用于DNA序列测定并可利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对DNA的特定片段进行体外扩增。在PCR过程中，由于Taq DNA聚合酶在变性步骤中（约94℃）不失活，可直接进入第二轮循环，因此不必每轮循环时重新加入新酶，这使得Taq DNA聚合酶成为PCR反应中的独特用酶。

中文名：TaqDNA聚合酶；外文名：Thermusaquaticus；酶基因全长：2496个碱基；氨基酸：832个；属性：热稳定DNA聚合酶；发现者：Saiki

热稳定性：

相对分子质量为94的Taq DNA聚合酶的活性较高，大约为200000 U/mg，在合成DNA时有一个较高的最适温度75～80℃。Taq DNA聚合酶虽然在90℃以上合成DNA的能力有限，但高温时仍比较稳定。有实验证明，在92.5℃、95℃和97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130 min、40 min和5～6 min后，仍可保持50%左右的活性，其半衰期较长。所以，在一个PCR预备试验中，每次循环时上限温度为95℃处理20S，则循环50次后Taq DNA聚合酶仍可保持65%的活性，能够保证实验的需要。

Taq DNA聚合酶具有很高的加工合成特性，在最适反应温度时，dNTP的掺入速度为35～100 nt/（s．酶分子），最长扩增长度可达7.6 kb。在低温条件下，Taq DNA聚合酶的活性明显降低，导致此酶在模板内局部二级结构区域的延伸能力受阻或前进速率常数与解离常数的比值发生改变。在较高的温度（95℃以上）时，很少有DNA合成；在体外，DNA在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链双链结构稳定性的限制。

由于Taq DNA聚合酶的最适反应温度高达75～80℃，故退火温度和延伸温度均可适当提高，这限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR反应的特异性。

功能：

Taq DNA聚合酶的氨基酸顺序，特别是氨基酸的前1/3区域，与大肠杆菌聚合酶I非常相似，因而它们属于一种多功能酶。

1．具有5'→3'聚合作用

可以以DNA为模板，以结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以Watson—Crick配对的方式按5'→3'方向沿模板顺序合成新的DNA链。

2．具有5’→3'核酸外切酶活性

Taq DNA聚合酶具有依赖于DNA合成作用的链置换的5’→3’核酸外切酶活性，无论单链DNA还是退火到M13模板上，5’端32P标记的寡核苷酸均不降解。另外，如果模板上有一段退火的3’磷酸化的阻断物会被逐个切换而不会阻止来自上游引物链的延伸，即它并不抑制在3'一OH末端上游引物的掺入。

影响因素：

（一）温度：虽然Taq DNA良合酶有很强的温度适应范围，但高于60℃的环境仍会使部分酶变性失活。反之，如果温度低于正常值，酶活性受到限制。而且由于引物在低温下（特别是25—27℃）可能与基因组中别的部分同源钓序列结合，使得一些扩增产物并非为目的序列。适当提高温度，错配碱基多会解离，反应产物特异性增加。Taq DNA聚合酶的最适应温度以70℃为宜；

（二）镁离子浓度：TaqDNA聚合酶活性对Mg2+的浓度非常敏感。TaqDNA聚合酶和许多其他聚合酶一样，是Mg2+依赖性酶。用鲑鱼精DNA作模板，dNTP的总浓度为0.9~0.8mmol/L，用含不同浓泼MgCl2的PCR系统使反应进行10分钟。测定结果表明：在MgCl2为2.0mmol/L条件下，酶活性显示盈高。Mg2+浓度偏高，酶活性会受到限制，10mmol/LMgCl2使酶活性抑制约50%。由于Mg2+可以与负离子或负离子团（如磷酸根）结合，而在PCR中，DNA模板、引物以及dNTP是磷酸根的主要来源，其中dNTP占有很大比例。因此反应系统中，Mg2+的最适浓度还要受到dNTP浓度的影响，欲获得最佳反应结果，要对反应条件进行必要的探索。每当一个新的目的片段和引物第一次使用时，或者某种参数（dNTP或引物浓度）改变时，应进行Mg2+的最适浓度滴定。一个普遍的原则是，样品中Mg2+的最终浓度至少要比dNTP总浓度高0.5~1.0mmol/L。

（三）KCl的最适浓度：一般是50mmol/L，高于75mmol/L时，聚链反应就受到明显的限制。当KCl浓度高达200mmol/L以上时，聚链反应就受到明显的限制，此时反应进行10分钟仍无核苷掺入．浓度均为50mmol/L的NH4ClNH4Ac以及NaCl对TaqDNA聚合酶活性影响则分别为中等抑制、无影响以及25~30%促进。

（四）dNTP的浓度：均衡的低浓度dNTP更有利于酶活性的发挥，并能减少错配，获得多量的特异性强的DNA反应产物。各种核苷酸浓度为40umol/L的100ulPCR系统可以得到2.6ugDNA产物，而只消耗所提供核苷酸的半量；

（五）几种变性剂对酶活性的影响：10%乙醇尚不抑制酶活性；二甲基亚砜（DMSO），二甲替甲酰胺（DMF）。甲酰胺在低浓度时对酶活性无影响，随着它们浓度的提高，酶活性明显下降。l0%DMSO会使酶活性减半。然而另有研究者观察到，在某些聚链反应系统中，10%DMSO起着有利作用。这种结构各异的现象还表现在用尿素进行的实验中。1.0mol/L尿素能提高酶活性，2.0mol/L尿素能保存大部分酶活性。然而也有报告认为0.5mol/L尿素则完全抑制PCR。总之，变性剂对TaqDNA聚合酶以及PCR系统的影响参数有待更多的实验数据。TaqDNA聚合酶对SDS十分敏感，而某些非离子型去污剂又能完全消除低浓度SDS对酶活性的抑制效应。例如，0.5%Twen20及0.5%NP40可抵销0.01%SDS对酶活性的影响。