农杆菌介导的植物遗传转化

实验概要

以烟草叶片为材料，与对数生长期的带有外源基因的农杆菌共培养，遗传转化烟草叶片，筛选抗性再生植株。掌握共培养过程关键技术环节及转基因植株的筛选。

主要试剂

70%乙醇

0.1% HgCl₂

无菌水

卡那霉素(kan)

羧苄青霉素(Cb)

培养基：LB培养基100ml；MS 盐溶液(pH 7.0)100ml，分装到50ml三角瓶中，25ml/ 瓶；MS基本培养基  500ml(固体)；分化培养基 MS NAA 0.2 mg/l  6-BA 3 mg/l，500ml  (固体)，分装在250ml三角瓶中，每瓶100ml；高压灭菌

抗生素母液：Kan 100mg/ml 5ml；Cb 500mg/ml 5ml 抽滤灭菌，分装在Ep 管中，每管1ml，-20℃保存。

主要设备

超净工作台

摇床

恒温培养室

高压灭菌器

冰箱

培养瓶

培养皿

500 ml三角瓶

50 ml与500 ml烧杯

酒精灯

枪形镊子

手术刀

实验材料

带有外源基因的农杆菌

烟草无菌苗叶片

实验步骤

1. 取普通烟草无菌苗叶片，用锋利手术刀片切去边缘和主叶脉，叶片切成0.5 cm见方的小块(使四周均有伤口)，备用。

2. 取培养过夜的农杆菌LBA4404(含有卡那霉素抗性基因，Gus基因)菌液，4,000 rpm，室温离心10 min，用MS盐溶液(pH 7.0)重新悬浮菌体，使用时用MS盐溶液稀释至原体积的20-50倍。

3. 将准备好的叶圆片在菌液中感染10 min后，将叶片取出，用无菌滤纸吸去植物材料表面菌液，转移到铺有一层无菌滤纸的MS培养基上，28℃暗培养，共培养3-7天。

4. 共培养后将材料转移到含有抗生素的分化培养基(筛选培养基) ( MS NAA 0.2 mg/l   6-BA 3 mg/l  Kan 100 μg/ml  Cb 500 μg/ml)培养，每15天继代一次。

5. 待抗性芽长到2-3 cm时切下，转至1/2 MS固体培养基上，生根培养基 (1/2MS Kan 100 μg/ml  Cb 500 μg/ml)诱导生根。

6. 利用生物化学和分子生物学方法检测这些转基因植株。

每组用农杆菌介导法接种烟草叶片1平皿。