冠状病毒的几个离心分离方案

方案一  连续蔗糖梯度：离心机，转头。
单管配置：
1）13PET管：20%-50%（W/W）连续蔗糖梯度。
用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度：用20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%（W/W）蔗糖液各1.5ml，从离心管低部逐层向上铺设（底部高密度），铺二管，直立在试管架上室温过夜，第二天早晨放入冰箱仅5℃预冷2小时。在蔗糖液上部加样品（约2ml）至距管口3mm。对称放入P40ST转头吊桶（转头及吊桶在冰柜中预冷过夜）对称双管，38,000rpm（256,000Xg）X 1小时，5℃ 加速8，减速7。
2）13PA管：20%-50%（W/W）连续蔗糖梯度
用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度：用20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%（W/W）蔗糖液各1.2ml，从离心管低部逐层向上铺设（低部高密度），铺二管，直立在试管架上室温过夜，第二天早晨放入冰箱5℃预冷2小时。在蔗糖液上部加样品（约2ml）至距管口3mm。对称放入P40ST转头吊桶（转头及吊桶在冰柜中预冷过夜）对称双管，38,000rpm（256,000Xg）X 1小时，5℃ 加速8，减速7。
结果：冠状病毒应沉降在蔗糖36%-40%之间（注意：空吊桶必须都按编号挂在转头上）

方案二 蔗糖阶梯梯度
单管配置：用0.01M Tris-Hcl配置蔗糖梯度，离心管下部为45%（W/W）（PET管为4ml，PA管为3ml），上部为32%（W/W）（PET管为4ml，PA管为3ml），表面加样品至距管口3mm（约为4.5ml）。对称双管，38,000rpm（256,000Xg）X 1小时，5℃ 加速8，减速7。
结果：病毒沉降在二个蔗糖梯度之间。

方案三  Percoll自形成梯度：转子（6X40ml）
单管配置：Percoll原液6.5ml，0.25M蔗糖23ml加样品6ml，充分混合后注入40PA离心管至距管口3mm冰箱中预冷2小时后制备二管放入吊桶挂在转头上（其余4个空吊桶也要挂上），20,000rpm，1小时，5℃ 加速8，减速8。
结果：病毒沉降在Percoll 1.06密度处。
梯度取出：1）手工取出：离心管倾斜小角度后用定量吸管吸出，13ml离心管分别收集26管（每管0.5ml），PA管分别收集21管（每管0.5ml），各管分别测OD给出OD→离心管管容量曲线,可以看到病毒峰,确定离心管编号后即可移出,蔗糖可通过透析除去.2）仪器收集:用日立 DGF-U梯度形成一收集仪,每次做一个管子,DGF-U后出口接流动池的分光光度计，连续测OD并绘出曲线后分部收集,根据病毒峰的位置,可以确定病毒集中在哪些离心管中,透析后得到较纯病毒液.

方案四 用冻融法制备的Nycodenz分离冠状病毒
单管配置 25% Nycondenz（密度1.127g/ml）8ml注入离心管，在-20℃冰箱中冻结，全部冻结后室温中溶化即成为（从液面到管底）密度从1.08g/ml到1.30g/ml的连续梯度，从1.08-1.16g/ml为凸指数曲线，从1.16-1.30g/ml为凹指数曲线。
     在已溶化的连续梯度上加入样品至距管口3mm（PA管约为2.5ml，PET管约为4ml）
日立P40ST转头，6x13mlTi吊桶，40,000rpm（284,000xg）12小时，加速8，减速7，20℃
离心后用DGF-U自动收集或人工收集成30管（每管0.3ml左右）在Nycodenz密度1.18g/ml处有病毒峰（离心管中段）。将30管分别测OD并绘制OD→管数曲线可找到病毒所在管。
对称管可用30%（W/W）蔗糖配置（密度在20℃时，1.127g/ml）