冷冻电镜单粒子法及其应用

冷冻电镜单粒子法使我们在分子水平对生命过程有了新的认识。核糖体是一个由多种结构相互作用形成的RNA蛋白质复合体，他的结构解析是对这种技术应用的最好说明。从7 0年代Ｆrank开始对核糖体进行单颗粒分析以来 ,二十多年的努力使得大肠杆菌70Ｓ核糖体1.5ｎｍ分辨率的三维结构已经得到揭示。

从这个三维结构模型中我们可以清楚地分辨出各RNA、蛋白组分和它们之间的连接关系。虽然一系列核糖体的三维晶体结构已有报道, 但单颗粒分析对于研究核糖体在蛋白合成过程中的结构变化仍是唯一有效的手段[12]。由于冷冻电镜可以捕捉到生物分子在不同活性状态下的瞬时构像，我们可以通过分子的构像改变来了解某个生命活动过程。转录的基本过程，mRNA剪接与移位便是成功的例子.核糖体合成蛋白质的整个循环过程中的不同 中间状态也已通过冷冻电镜确定。通过这些不同状态的密度图，我们可以确定tRNA和延长因子结合的顺序过程，同时也可描述核糖体亚基自身的构像变化。这些运动是mRNA转位和新生肽链延长的基础。

理解生物大分子和大的复合物的反应机制是当今生物学领域里的一项重要目标。而完成这项任务的途径便是通过鉴定关键反应的中间过程并把握其特征。实间分辨（time-resolution）的冷冻电子显微镜便是一种方法，可使空间分辨率达1nm左右，时间分辨率达到数毫秒。冷冻电镜是仅有的从总体上来讲适合于在快速时间分辨率上研究大分子及其复合物的构象变化的一种方法。快速冷冻以捕捉反应中间体的可能性许多年以前就已经清楚了，但是只有在引入了喷雾方法以快速混合样品中的大的和小的分子并形成足够薄的样品以利于进行显微成像之后才变为可行。第二代时间分辨冷冻电镜仪器使用分档器和电喷雾技术，运用冷冻电镜来研究生物大分子及其复合物的瞬时反应的构像。通过在几毫秒到几十秒的时间内将反应物快速冷冻以捕捉反应中间过程。将样品点到电镜铜网上并在液态乙烷中冷冻后使用计算机控制之后的显微步骤。为了获得最大的时间分辨率，在冷冻前可向已覆盖有一薄层反应物的铜网上喷洒含有另一种反应物的液滴。该过程是在电场作用下进行的电喷雾，每个载网需1-2μl的溶液进行喷雾，产生小于1μm的雾状液滴。第二种方法是冷冻前先将两种溶液用搅拌器混匀再点到载网上，这种方法用于反应时间大于1s的反应物。蛋白质反应的结构变化可以在10-15 s内发生，但像结构域的变化幅度较大，在毫秒刻度范围内发生，通过冷冻电镜可获得中等分辨率（~1nm）的解析。也可以通过X-ray和NMR技术获得原子分辨率的结构解析。

冷冻电镜获得的生物大分子复合物的7-9 分辨率的结构信息中包含了单个蛋白质成分或结构域的生物信息，因此能够指导形成一种完整的复合物的折叠模型。用这种方法已获得了大稻侏儒病毒6-8 的结构，结合生物信息学提出了其主要衣壳蛋白的折叠模型。