冷冻电镜单粒子法

三维冷冻电子显微术已经在确定结构组成和大分子复合物的结构层次方面取得了重要进展。单粒子冷冻电镜技术是获得三位重构图像的重要的方法。单粒子法就是对分离纯化的颗粒状分子进行结构分析。既可以对有二十面对称结构的病毒或螺旋对称结构进行分析，也可以对象核糖体等大的可溶性复合物进行结构分析，还可以对溶解状态的膜蛋白进行分析。其基本原理是通过对相同的生物大分子某方向的投影显微像在时空中经调整后进行叠加，从而提高信噪比，最后将不同投影方向的单颗粒显微像在三维空间进行重构获得单颗粒大分子的三维结构信息。主要步骤可分为以下几点：

1、制备化学和结构上均一的生物大分子的冰冻含水样品，

2、选择最有可能能够产生最佳图像的最佳的颗粒密度和玻璃态冰厚度的样品，

3、设定最佳的参数（比如：欠焦值、放大倍数和电子剂量等）记录这些样品区域的大量图像，

4、用手工或半自动程序选择那些离散的分子形成的投影图，

5、通过计算不同图像之间的相对方位来重组出复合物的三维结构模型。

6、最后可以利用从晶体学或NMR获得的结构将原子坐标定位到密度图中。

为了使结构的分辨率接近10 或更高，也可以对在分离的和复合的大分子环境细微的结构差异进行校正不用结晶是该方法的最大优点，而且对于研究传统方法不易研究的大分子复合物像核糖体有很大优势。

由于低剂量的电子辐射使得图像的信躁比(SNR)非常低，要提高信躁比，就必须采集更多的图像数据，通常要求>10 000张，才能满足分子分辨率的要求，而要获得原子分辨水平（~4 ）的结构需要上百万张图像，若要人工处理这些数据将是一项耗时乏味的体力活，也因此成为冷冻电镜获得高分辨图像的一个瓶颈，因此需要发展自动化采集单离子图像的方法，该方法发展将成为冷冻电镜领域里一项重要课题。Nicholson, W.V.等人在2001年的综述中把几种不同的单粒子选择方法归纳为五类:1、Template-based 方法;2、edge detection-based 方法;3、Intensity comparision方法;4、Texture-based方法;5、Neural network方法。近来大量研究小组在该领域里取得了重要的进展，出现了一些改进的方法，比如learned-based 方法,TYSON local variance方法, 两步法等。Journal of Structural Biology 145(2004) 这一期集中介绍了在单粒子法中图像自动采集方法的研究进展。尽管运用冷冻电镜单粒子法还无法获得足够高分辨率的三维结构以建立条带结构模型，但测定的结构中可达到的分辨率已小于10 。随着计算机图象处理技术的发展尤其是图象自动采集技术的应用，数据收集会越来越快，分辨率也会逐步提高。

想要将三维冷冻电镜方法建立为测定三维结构的常规方法理论上，除了在颗粒图像选择方法上建立自动化技术外，还需要在各个步骤进行改进，实现自动化过程。包括样品制备，数据收集，结构校正，以及将X-ray图与电镜密度图重叠已获得更全面的信息。其中一些已取得了一定的进展. 图像探测技术对分辨率也有很大影响新一代的4K×4K CCD（charge-coupleddetector）照相机可以在120KV电压下在10-15 分辨率水平上进行扫描拍摄图像，并且可以在低放大倍数下从中央记录图像并确定玻璃化冰的厚度