凝胶色谱讲义

第一章  前言

一、高聚物及多糖平均分子量及其分布

1、高聚物的平均分子量

除天然聚合物外，合成聚合物都是以单体为原料经过聚合反应而制得的。每个聚合物分子都是由数目很大的单体分子加成或缩合而成，所以合成聚合物的分子量比单体要大千百倍甚至成万倍。另一方面，根据绝大多数的聚合反应机理预示，生成的聚合物的分子量是不均一的，也就是说每个聚合物分子可以由不同数目的单体分子聚合而成，所以各聚合物的分子量是不相等的，这种现象叫做聚合物的分子量的不均一性或多分散性。高聚物分子量的多分散性使分子量的表征比小分子要复杂一些，拿一个高聚物试样来说，由于试样内包含有许许多多个高分子，这些高分子的分子量可以分布在相当大的范围内。例如，试样中可以包含尚未聚合的单体、含二个、三个、四个、…单体的低聚物以及聚合度不同的高分子，对这样一个多分散的体系来说，我们要表征它的分子量就需要用统计的方法，求出试样分子量的平均值和分子量分布、由于应用统计方法的不同，即使对同一个试样，也可以有许多不同种类的平均分子量；例如，某一个高聚物试样中含有N1个分子量为M；的分子，N2个分子量为M2的分子，N3个分子量为M3的分子，……Ni-1个分子量为Mi-1的分子以及Ni个分子量为MI的分子，我们就可以根据定义算出它的各种平均分子量。下面是四种最常用的平均分子量定义：                                                     

这里：      

另外，粘均分子量：

很显然，同一个试样应用不同的统计方法所算出来的不同种类的平均分子量的数值是不同的。一般情况下，多分散样品的平均分子量有以下次序：  Mz＞ Mw ＞ M η＞ Mn

2．高聚物的分子量分布

高聚物的分子量分布是指试样中各种大小不等的分子量组分在总量中所占的各自的分量，它可以用一条分布曲线或一个分布函数来表示。例如，当我们知道高聚物试样中分于量为M1、M2、M3、…、Mi各组分在总重量中所占的重量分数分别为 W1 、  W2、  W3 、…、  Wi 时，我们就可以用对应的 W和M作图，得到分子量分布曲线。用重量分数（分子数分数也一样）对分子量作图的分布曲线，我们称它为归一化的分布曲线，因为曲线下面的面积总和等于1。分子量分布曲线有二种画法：用重量分数w对M作图的曲线叫微分分布曲线：用累积重量分布（I）对分子量M作图的曲线叫积分分布曲线。由于高聚物的分子量一般在10⁴--10⁷范围内，这是一个很大的数目，而相邻组分间只差一个单体的分子量，所以可把分子量分布看作是一个连续变化的函数。

3、分子量分布宽度

试样间分子量分布宽度的比较，最直接的方法是将实验所得到的分子量分布曲线作对比。从归一化的微分分布曲线或积分分布曲线都可以很方便地把定性和定量的差异检查出来。这种用分子量分布曲线对比的方法在工厂定型产品的对比中很实用。还有一种更一般化的定量方法，那就是定义一个多分散程度的参数，如用多分散指数来表示。在文献中曾经提出过不少表示多分散度的指数，其中最常用的是重均数均比，Mw／Mn。这个比值随分子量分布宽度而变化。在单分散时，Mw／Mn等于1，随着分子量分布变宽，MW／Mn值逐渐变大，目前实验能够合成的“单分散”试样Mw／Mn值在1.02到1.l之间，而一般多分散试样重均数均比值在1.5—3.0之间，而分子量分布比较宽的如聚乙烯，Mw／Mn值可以高达20—30或甚至更高。用Mw／Mn值来表示多分散度是很方便的，从实验上来说既可以从两种实验方法测定两种平均分子量来得到，也可以从实验得到的分子量分布曲线分别计算Mw和 Mn来得到。在某些情况下，当分子量分布中高分子量尾端或低分子量尾端对性能影响比较大时，也可以用累积分布曲线中90％处的分子量与50％处的分子量的比值M90／M50，或50％处的分子量与10％处的分子量的比值M50/M10来表示多分散度。前者对高分了量尾端较敏感，而后者对低分子量尾端较敏感。选择何种指数来表示分布宽度可以根据具体情况来决定。

二、高聚物分子量及其分布测定方法

聚合物溶液，特别是稀溶液，它的物理性质往往和聚合物的分子量有关。例如，溶液的渗透压、沸点、冰点都与体系中的分子数目有关，因而由此可测聚合物的数均分子量：又如，溶液的光散射能力与体系中大分子的重量有关，因而由此可测重均分子量；溶液的粘度与体系中的分子数目、分子大小、分子形状都有关，因而由此可测粘均分子量以及分子尺寸。各种聚合物分子量的测定方法及其适用范围列于下表：

和测定分子量一样，测定分子量分布也是最基本、最重要的实验技术。分子量分布布测定的经典方法有沉淀分级法与溶解分级法，都是根据聚合物的溶解度对分子量的依赖性；凝胶色谱法是目前分子量分布测定的最理想的方法，是基于聚合物溶液中的溶质分子大小不同而达到分离之目的。

三、多糖类药物分子量及其分布测定的意义和方法

多糖是由单糖缩合而成的链状结构物质，是自然界中广泛存在的一类生物大分子。由于多糖分布的广泛性、结构的复杂性和生物作用的多样性，使人们对它的药用研究越来越重视，它将作为一类高效、低毒、新型药物广泛应用于人类疑难疾病的治疗。

多糖是天然高分子中具有多分散性的聚合物，为了鉴定一种聚合物，首先必须测定其分子量与分子量分布，这是高分子化合物的最基本参数之一。多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项重要工作。多糖的理化性质及活性与多糖的分子量及其分布有关，如右旋糖酐分子量为10万～  20万时能使血液中红细胞聚集，而分子量为2万～4万时，不但不使红细胞聚集，反而使已聚集的红细胞解聚，所以不同分子量的右旋糖酐在临床上有完全不同的应用，这些现象在羟乙基淀粉、羧甲基淀粉及一些果胶中也有类似的情况。又如低分子肝素是近十几年发展起来的新一代肝素类抗血栓药物，其抗血栓作用优于肝素，而抗凝血作用却低于肝素，它具有生物利用度高，体内半衰期长，出血倾向小，口服易吸收等特点，目前已广泛用于临床。因此对于多糖类药物，为了确保生产工艺的稳定性以及临床用药的安全有效性，分子量及其分布的测定是尤为重要的。

目前用于有机高分子分子量测定的许多物理方法，一般也适用于多糖。此外根据多糖的化学特性也另有一些化学方法。多糖分子量测定因其不均一性往往比较困难。通常所测的分子量一般只能是一种统计平均值。离心沉降法、光散射法和渗透压法均可测定多糖的分子量。离心沉降法（沉降速度与沉降平衡法）测分子量要求粒子均匀、大小形状相同，才能得到溶质与溶剂之间的清晰界面。多糖的不均性界面不易清晰。分子量较大的多糖不易制得真溶液。光散射法所测结果因凝集作用很易变大，且对于分子量一低于一万的样品测定误差大。粘度法是实验室常用且比较简便的方法，但它是一种间接的且相对的分子量测定方法，它需要通过Mark－Houwink经验公式换算才能得到粘均分子量。但是对于一种新的多糖其Mark- Houwink经验公式是很难得到的。另外还有还原末端法、聚合度法等分子量测定方法，但都存在实验繁琐误差大等缺点，不适合用于多糖类药物质控。70年代以后，由于耐压合成凝胶的出现，水相高效凝胶渗透色谱法（ HPGPC）开始用于多糖的分子量及其分布的测定，它具有快速、高分辨和重现性好等优点，是多糖类药物分子量测定的较理想质控方法。