凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)

实验概要

凝胶迁移或电泳迁移率实验是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。通常将纯化的蛋白或细胞粗提液和标记的DNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物比非结合的探针移动得慢。标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，粗蛋白或核细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA片段和寡核营酸片段(特异)和其它非相关的片段(非特异)来确定DNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

实验步骤

1. 探针的标记

探针为含有与蛋白特异结合的中心盒，大约20 bp左右，使用pierce公司的3’末端标记试剂盒(PIERCE，Rockford，IL，USA)标记。操作步骤参照说明书，具体步骤如下：

   1) 将试剂盒中除TdT以外的其他组分解冻并置于冰上。迅速稀释TdT：Sx TdT Reaction Buffer 2 u1，超纯水7 ul 20 U/ul TdT 1 ul。稀释后得到1 Xdiluted TdT(2 U/ul)，稀释后的TdT必须现配现用，稀释后不能保存。

   2) 反应体系：5x TdT buffer 10 ul，DNA 5 pmol，Biotin-ll-UTP 5 ul，diluted TdT5 ul，超纯水补足50 ul。在37℃温浴3 0 min，加入2/5体积0.2 M EDTA，终止反应。加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提TdT，涡悬充分，高速离心3 min，取上层即为标记探针，分装后-80℃保存。

2. 非变性电泳

   1) 非变性电泳：30%丙稀酸胺2.66 ml，TBE(5X)2 ml，10%过硫酸按1.4 ml，TEMED7 ul，双蒸水补足20 ml。按照上述配方配置4%的非变性胶。在烧杯中迅速混匀，置于冰上，灌胶，待凝胶聚合后拔出梳子，用双蒸水洗点样孔，再用0.5xTBE清洗点样孔。

   2) 样品准备：按照不同的组合加入DNA和蛋白，另外还需要加入结合缓冲液，如果是粗蛋白还需要加入poly(dI.dC)(试剂盒中有)抑制非特异性条带的产生。

   3) 电泳：预跑胶30-60 min，100 V。上样。跑胶，100 V，30 min左右。注意电泳要在冰上完成，以防止电泳时产生热量使不稳定的复合物解离。

   4) 转膜：电泳跑好后，将胶取下，放在大小相似的尼龙膜上，上下各加一层润湿的blotting paper，放到半干转移装置上，100 V，380 mA，转膜1 h。

   5) UV交联：取出膜。在紫外交联仪中999.9 mJ，固定10 min。

   6) 洗膜：

      a. 将Blocking Buffer和4XWash Buffer置于37-50℃使其溶解。

      b. 用20 ml of Blocking Buffer封闭膜，温浴15 min，摇床轻摇。

      c. 在20 ml Blocking Buffer中加入66.7 ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate(1：300稀释)，配置成conjugate/blocking solution。

      d. 将膜从blocking buffer中取出，在conjugate/blocking solution中轻摇15 min。

      e. 将4XWash Buffer用双蒸水稀释成1 Xwash solution。

      f. 将膜置于新的培养皿，用20 ml 1 Xwash solution冲洗。

      g. 用1 Xwash solution洗膜4次，每次5 min，摇床轻摇。

      h.在新培养皿中加入30 ml Substrate Equilibration Buffer，将膜放入，温浴5 min，摇床轻摇。

      i. 将6 ml Luminol/Enhancer Solution和6 ml Stable Peroxide Solution避光置于锡箔纸包好的烧杯中，摇匀，作为Substrate Working Solution。

      j. 将膜从Substrate Equilibration Buffer中取出，用滤纸尽量吸去液体，放入新的培养皿。

      k. 将Substrate Working Solution用枪慢慢加到膜上使液体尽量到达整张膜，静置5min。

      l. 取出膜，控制膜不能干燥。

      m. 用保鲜膜将膜包好，不能有气泡。

      n. 在暗室中，将膜放入曝光盒，用X-ray胶片压片，曝光时间随温度变化而不同，室温一般1 min。然后将胶片取出，经过显影，水洗和定影可以看到实验结果，如果胶片长期保存一定要在水龙头底下长时间冲洗，晾干后可拍照。