凝集素去除半抗原糖

　　蛋白质糖基化的检测实验

　　实验方法原理

　　用酶或化学脱糖基化、通过选择性标记或通过凝集素亲和层析法是检测蛋白糖基化常用方法。

　　实验材料

　　蛋白样品

　　试剂、试剂盒

　　磷酸钠缓冲液 蛋白溶液 β-巯基乙醇 NP-40 溶液

　　仪器、耗材

　　SDS-PAGE 玻璃器皿 植物凝集素柱

　　实验步骤

　　一、用 PNGaseF（N-多糖酶）处理

　　 以 0.1 mol/L 磷酸钠（或 Tris-HCl，而不用柠檬酸）缓冲液，pH 7.4 ( 7.0~8.0 ) 配制高达 2 mg/ml 的蛋白溶液，并含 50 mmol/L β-巯基乙醇和 0.1% SDS，在水浴中煮沸 2 分钟。加 1/10 体积的 10% NP-40 溶液（或使 SDS 浓度少于或等于 0.17%，NP-40：SDS 的质量比在终反应中至少是 7:1)。加 PNGaseF 到终浓度为 6 mU/ml。注意这里的 1U 相当于在 1 分钟形成的 1 微摩尔产物；--些厂家用 1U = 1 nmole/分 在 37℃ 中保温 16 小时，以完全脱糖基化。用 TCA/DOC 按照下列步骤沉淀以制备 SDS-PAGE 样品。

　　(1) 在样品中加等体积的含 50% TCA 的 10 mmol/L DOC 溶液，并且在冰上放置 20 分钟。

　　(2) 以最大速度（16000 g)，4℃ 下离心样品 15 分钟。

　　(3) 用冷丙酮清洗沉淀一次，并再次离心样品。

　　(4) 用 SDS-PAGE 样本缓冲液重悬最后的沉淀，如有必要，可用小体积的 1 mol/L Tris pH 8.0。将悬液调至 pH 8.0 样品上样至凝胶上进行电泳。

　　二、用 EndoH 处理

　　 在 100 mmol/L、pH 5.5 的柠檬酸钠缓冲液中制备浓度达到 1 mg/ml 的蛋白样品。用 10 mU/ml 酶 37℃ 消化样品过夜。按常规的方法处理样品用于 SDS-PAGE 分析。

　　三、酶去除 O -多糖

　　 二甲胂酸钠（磷酸盐或马来酸盐，但不是 Tris-HCl ) 中制备浓度 5 mg/ml 的蛋白，pH 6~7.6。用 10 mU/ml 的酶消化样品，在 37℃ 孵育过夜。按照 PNGaseF 第 4 步所述的方法（TCA/DOC 沉淀）处理反应混合物以进行 SDS-PAGE。

　　四、来自产脲节杆菌的唾液酸苷酶

　　 以 pH 5.0、50 mmol/L 醋酸钠制备 0.5 mg/ml 的蛋白溶液。加 10 mU/ml 的唾液酸苷酶，37℃ 下保温 12~16 小时。制备样品用于 SDS-PAGE 分析。

　　注意事项

　　 一个特殊的、未经分级的“脱糖基化级”PNGaseF和EndoF混合物可以从一些厂家买到。如果要用对碳水化合物特异的检测方法检测脱糖基化，应该记住：EndoF在一些糖基化位点上会留下抗-PNGaseF的GlcNAc基团。放射标记的蛋白对植物凝集素亲和层析是特别有用的，因为结合和洗脱的检测能够用液闪计数迅速获得。然而，如果可能，这些结果一定要通过电泳确证。对于蛋白纯化，植物凝集素余和介质被证明是有用的，既可以保留住目的蛋白，也可以除去大部分不同糖基化的蛋白。如果需要去除半抗原糖，用来脱盐的凝胶过滤柱子通常就足够。