凯氏定氮法的实验原理

　　一、实验原理
　蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液 滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。含氮量*6.25=蛋白含量
　　1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4

凯氏定氮法
凯氏定氮法反应式为：
　　2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）
　　2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中反应式为:
　　(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4

　　2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

　　3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量

　　反应式为：

　　(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3

　　(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

　
　　　二、操作
　　　1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。但是此法比较危险，不易在实验室演示，现在大多数实验室有消煮仪一次可以进行多个（一次可以消煮16个样品）样品处理，并有通风橱进行通风，温度可以自己设定，更加安全和可操作性，因此逐步成为主要的凯氏定氮法的首选处理方法。
　　一般消解温度都设在240度及240度以上，如果想快速消解可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解。
　　2、按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红 指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
　　3、向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，不能立即将玻璃盖塞紧，这样易使玻璃塞粘在进样口，应先用蒸馏水冲洗然后再盖，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。
　　同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。
　　
　　三、计算　　
　　X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%
　　X：样品中蛋白质的百分含量，g；
　　V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
　　V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
　　N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
　　0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
　　m：样品的质量（体积），g（ml）；
　　F：氮换算为蛋白质的系数 。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。