【分享】质谱分析蛋白的原理与方法

　　 质谱技术具有较好的灵敏度、准确度，能准确测定蛋白质。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要的地位。[1,2]质谱有进样器、离子源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析系统等组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）等，各种质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的且准确快速的途径。目前，酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用已成为鉴定蛋白质的发展趋势。

　　质谱法分析蛋白的基本原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白。通常结合相应的处理及其他技术，能够比较准确、快速地鉴定蛋白质。

　　质谱分析蛋白的方法：

　　用于质谱分析蛋白质的方法主要有三种：肽质量指纹图谱法（PMF）、串联质谱法（CID）和梯形肽片段测序法（ladderpeptide sequencing）。

　　肽质量指纹图谱（PMF）

　　肽质量指纹图谱（PMF）即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白质切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的相对分子质量，将所得的蛋白酶解肽段质量数在相应的数据库中检索，寻找相似肽指纹谱，从而绘制“肽图”。由此可见，分子质量的精确度是PMF的关键指标所在，但蛋白质的翻译后修饰可能使PMF的质量数与理论值不符，故这就需要与序列信息适当结合。

　　串联质谱法（CID）

　　串联质谱法（CID）是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳定离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。串联质谱的肽序列图需要读出部分氨基酸序列与前后的离子质量和肽段母质量相结合，这种鉴定方法称为肽序列标签（PST）。

　　梯形肽片段测序法（ladder peptide sequencing）

　　梯形肽片段测序法（ladder peptide sequencing），与Edman法有相似之处，是用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，产生包含仅异于1个氨基酸残基质量的系列肽，名为ladder，经质谱检测，由相邻肽峰的质量差而得知相应氨基酸残基。其中的问题是由于酶解速度不一，易受干扰。

　　蛋白质质谱分析中的问题

　　蛋白质消化

　　蛋白消化蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6 -20 个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。

　　蛋白质修饰问题

　　 在目前条件下，质谱很难100%给出肽段的序列，经常会丢失一些肽段，蛋白质磷酸化修饰也会抑制胰蛋白酶的酶解，并且磷酸化肽的含量较非磷酸化肽段的含量少很多，质谱对磷酸化肽的响应就可能会被抑制。因此，要尽可能把非磷酸化肽段的含量降到最小。减少非磷酸化肽的方法有分馏、IMAC（固相化金属亲和色谱）和抗体结合。

　　通过MALDI-TOF-MS测定肽段的分子量，根据所得肽段分子量比预计的分子量大80Da或其整倍数，判定是否存在磷酸化修饰。

　　精确度问题

　　 在质谱序列测定中，质谱的准确性对测定结果有很大影响，这是由于质谱测序的关键在于测定相邻肽链之间的分子量差别以判断相应的氨基酸残基。如果测量的绝对质量误差在0.5以上，则不能够有效区分质量数差在1以内的氨基酸残基。