分子克隆蛋白表达实验指南（一）

目的基因克隆包括保存用全长基因(gene for saving, GS)和表达用全长基因(gene for expression, GE)两部分。
  这两部分所克隆的基因都是全长片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精确克隆(及引物从基因CDS两端开始)很难找到高效价的引物，且cDNA中目的基因很少，成功克隆出基因很困难。因此我们选择在CDS两端设计高效价引物，先将基因从cDNA文库中克隆，将克隆插入T载体中。之后再设计一对用于精确克隆的引物，以插入目的基因的重组T载体为模板，克隆出用于表达的基因，插入T载体。GS目的基因的拷贝数很高，及时引物效价不高，仍然能获得GE。
  全长基因难以获得时(如GC含量较高)，可克隆目的基因中800～1000bp的片段用于表达。
  1．  细胞复苏及培养
  a．  确定细胞复苏用得培养液。培养液使用前37C水浴温育。
  b．  预先准备10ml的相应培养液，用于洗涤复苏细胞
  c．  从液氮中取出cell后，37C温育至融化。开盖前用酒精消毒
  d．  用移液管将复苏细胞转入step b中的培养液中洗涤，除去冻存cell中的DMSO
  e．  1000rpm，5min，去上清，轻轻振荡重悬cell，加入1ml左右新培养液，混匀
  f．   转移cell至含20ml左右培养液的培养瓶中，盖口不能拧紧，37C培养至培养瓶壁贴满cell
  g．  培养约2－3天至细胞贴满培养瓶壁时将细胞传代，分装两个培养瓶，一个保种，一个抽RNA。
  
  2．  RNA抽提

  悬浮细胞            组织器官                   单层贴壁细胞

  （5-10X106）        (50-100mg)                     107

  1000rpm，5min离心       匀浆           胰酶消化至细胞悬浮，1000rpm，5min离心

                       PBS洗涤两次(PBS无须DEPC处理)，

  1mlTRI REAGENT 裂解，用枪吹打混匀，室温5min
                      可-20度保存留用，or
  200ul 氯仿（剧烈摇匀vortex，室温5min,ice 5 min）

  12000g 15min 4℃
      取水相（500ul以上）加入等体积异丙醇(室温5min,ice 5min)

  加完异丙醇立即上下颠倒5－10次混匀，若同时抽多管，则每次加完一管后都应立即混匀
   12000g 15min 4℃
                      倾倒除去上清，并用枪吸干

  1ml 75%乙醇 wash一次，用枪吹打均匀

  7500g， 5 min  4℃
  去上清，尽量用枪吸尽

  air dry the RNA pellet ,2～3min
  do not let RNA turn translucent

  50 ul ddH2O (DEPC treated) dissolve by a pipet

  检测O.D值/1% agsrose 电泳
     RNA分装成10ul后冻存，防止反复冻融使RNA降解。取RNA时一定带上手套，避免手上的RNA酶污染。
    抽提RNA后应跑核酸电泳检测RNA纯度及降解程度。一般RNA抽提后应在700bp～1.5kb范围内有两条清晰的带。
  3．  Reverse Transcription
  System（40ul）
        5X buffer                  8ul
        0.1M DTT                 4ul
        dNTPs(10mM)             8ul
        RNAse inhibitor             0.5ul
        Superscriptase                1ul
        Oligo（dT）12-16 (0.5ug/ul) 1 ul
  Sample RNA (4ug)        4ug
        DEPC H2O                 add to 40ul
  将Oligo
  dT与RNA，DEPC水混匀后，70C水浴10min(封口)，冰浴2-3min，加入其余上述混合液，37C水浴1.5h，95C水浴5min(封口)，冰浴，-20C
  store。RT-PCR水浴时封口膜封EP管，防止水蒸发影响反应体系。
  RT-PCR后用持家基因HPRT引物PCR，检测RNA抽提质量。HPRT退火温度60C左右。HPRT长度较小，为与引物二聚体区别，PCR时需做一不加模板的空白对照