分子克隆蛋白表达实验指南（二）

取DEPC水时切记带上手套
  
  Genequant使用方法：
  开机－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否为320nm)－set-ref(此时插入空白对照)－样品
  1．使用前将比色皿中水吸出，用1ml蒸馏水重新洗涤再将比色皿中的水吸尽（先用1ml枪吸，后用100ul枪吸）。
  2．加80ul水测对照
  3．2ul RNA稀释40倍测浓度
  4．测完后看RNA浓度（conc键），ratio值（ratio键）

4．  引物设计
  利用VectorSuite NTI设计目的基因引物(克隆产物用于保存时，引物不用加酶切位点；用于表达蛋白时，引物两端须加上相应的酶切位点)
  引物设计注意事项：
  a．  所设计引物的rating值最好为171，两个引物的Tm值不能相差太大，最好在1C之内。Tm值应在50－70C之间，不能太小。
  b．  设计好后，用NTI选择引物二聚体较少的primer，dimer最多不能超过8对。
  c．  将NTI软件中的所有酶切位点全部加入。系统默认的酶切位点很少。
  d．  目的基因片断中不能包含引物两端的酶切位点。
  e．  酶切位点两端应加对应的保护碱基。
  f．   对照相应的载体核对阅读框是否正确。注意载体a,b,c亚型ORF的区别。
  g．  选择普遍表达、实验室有相关cDNA的基因或基因亚型。
    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed
  h．  当表达载体的tag在C端时要注意插入片段后对tag读码框的影响。如his tag，要防止它因为读码框改变而变成Pro或Thr。
  i．   核对读码框，保证质粒插入片断后不影响其MCS后面的终止子ORF，使融合蛋白能够有效的终止。
  j．   目的片断的GC含量不能超过70%，最好65%以下。高GC值片断PCR不易成功
  k．  3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G或C 结尾，防止AT 的松散结合引起错配
  每条引物合成2OD（1OD约为33µg）
  
  引物稀释
  每个引物稀释成10µmol/ml
  所加水量＝3.3*10e6/MW µl
  
  5．  PCR
  PCR退火用不带酶切位点和保护碱基那一段引物的退火温度。该温度可以用Vecter
NTI查询。用梯度PCR仪进行不同退火温度条件摸索。一般变动范围为8C即可。
  Taq PCR摸复性温度
  System(30µl):
               10*reaction buffer(for Taq enzyme)   3µl
               MgCl2                          1.8µl
               dNTP                           1.5µl
               primers                         As 1µl
                                              Sp 1µl
               cDNA                           0.5µl
               ddH2O                          21µl
               Taq                             0.2µl
  体系中cDNA和primers的量可以根据实际情况进行调整。如：PCR不能拉出产物时可以增加cDNA量至1µl。