“分子诊断万花筒”小白篇：CRISPR／Cas技术简介

今年的诺贝尔化学奖授予两位女科学家，以表彰她们在CRISPR/Cas技术上的卓越贡献。隆地熊对于CRISPR/Cas系统能这么早就被诺贝尔奖垂青，深感欣慰。这项技术的出现已经引发了新一代分子诊断的发展。它进一步提升了分子诊断的特异性和灵敏度。回归后的隆地熊有意对CRISPR/Cas技术进行简单概述，重新开启“分子诊断万花筒”小白篇。

------------------------------------------------------------------------------------------------------

CRISPR/Cas技术顾名思义就是基于CRISPR/Cas系统的一类生物技术。CRISPR/Cas系统是一种原核生物如古细菌内类人体免疫系统的防御系统，以抵抗外源物质如噬菌体的入侵。首次受到入侵时，外源性遗传物质会被嵌入形成记忆。当再次受到入侵时，就会及时做出响应进行抵御。

CRISPR是clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats的简称，即成簇规律间隔短回文重复序列，在已测序细菌中占约50%，而在古细菌中高达90%。如图1所示，在序列上CRISPR是由重复区（repeat）和间隔区（spacer）两部分组成。重复区的序列在同一细菌中高度保守，但不同细菌间有少许差异，片段较短（21-48 bp），含有回文结构。回文结构的特点是单链时可形成发卡结构，而双链时能形成十字结构。每个CRISPR/Ca位点中约含2-375个重复区。间隔区则是被细菌嵌入或捕获的外源性核酸序列，在二次入侵时可充当利箭，直达目标对象。每个CRISPR/Ca位点中约含1-374个间隔区，序列多变，每个间隔区约26-72 bp。

图1. 典型的CRISPR/Cas位点结构组成

在CRISPR序列上游部分则是启动CRISPR序列转录的前导区（leader），相当于启动子角色。再往上，就是负责编码与CRISPR序列共同作用的蛋白质的CRISPR关联基因，即CRISPR associated genes（cas genes）。其所编码的蛋白就是Cas酶，即CRISPRassociated proteins（Cas proteins）根据编码蛋白的序列相识度，已发现的93个cas基因可归为35个家族，其中11个家族形成cas内核，覆盖Cas1至Cas9蛋白家族。一个完整的CRISPR/Cas系统至少含有一个能形成cas内核的基因。Makarova等人（Nature Reviews Microbiology,13, 2015:722–736）将目前的CRISPR/Cas系统分为两大类：Class 1和Class 2。Class 1 CRISPR/Cas系统常常需要多种Cas蛋白合作才能降解外源核酸，而Class 2 CRISPR/Cas系统则只需一种大的Cas酶即可完成降解功能。Class 1 CRISPR/Cas系统内的Cas蛋白有I、III和IV三种；Class 2的Cas蛋白有II、V和VI三种。这六种类型的Cas蛋白又包含19种亚型。比如常见的Cas9蛋白属于Class 2 II类，Cas12a （又叫Cpf1）属于Class 2 V类V-A亚型，Cas13a（又叫C2c2）属于Class 2 VI类VI-A亚型。

目前，研究最为深入且应用最广的就是CRISPR/Cas9系统。图2所示为分离自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Class 2 II-A亚型CRISPR/Cas9系统结构组成。

图2. 分离自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Class 2 II-A亚型CRISPR/Cas9位点结构组成

       当外来物种入侵时，CRISPR/Cas9位点启动转录，分别合成出crRNA反式作用体（trans-acting crRNA即tracrRNA）、crRNA前体（precursor crRNA即pre-crRNA）和Cas9蛋白。如图3所示，Cas9蛋白和tracrRNA首先在pre-crRNA上识别、绑定形成复合体。在RNase III的帮助下，pre-crRNA别切割形成crRNA中间体。而后，Cas9介导二次切割，形成成熟的crRNA。此时，Cas9、mature crRNA和tracrRNA形成功能性复合体，以执行对外源核酸的切割降解。

图3. S. pyogenes Class 2 II-A亚型CRISPR/Cas9系统中成熟crRNA（mature crRNA）形成过程

至此，大家应该对什么是CRISPR/Cas系统有了初步的认识。事后，隆地熊还会进一步介绍其在基因编辑与分子诊断上的应用。

参考文献：

1. Jennifer A. Doudna andEmmanuelle Charpentier. Science, 28, 2014. DOI: DOI:10.1126/science.1258096

2. Kira S. Makarova etal. Nat. Rev. Microbiol. 13, 2015: 722-736. DOI: 10.1038/nrmicro3569.

3. Hélène Deveau, JosianeE Garneau and Sylvain Moineau. Annu. Rev. Microbiol. 64, 2010:475-493.DOI: 10.1146/annurev.micro.112408.134123

4. Kira S. Makarova et al. Nat. Rev.Microbiol. 18, 2020: 67-83. DOI: 10.1038/s41579-019-0299-x.