利用大引物PCR在同一试管中进行高效快速定点诱变实验

扩增缓冲液含有四种 dNTP 的混合溶液热稳定 DNA 聚合酶琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶正向和反向内引物诱变引物模板 DNA

带屏障装置的自动移液器用吸头微型离心机用离心管可调式移液器

材料

缓冲液和溶液

贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1。
将贮存液稀释到合适的浓度。

10x 扩增缓冲液

含有四种 dNTP 的混合溶液，每一种 dNTF 的浓度为 2.5 mmol/L

酶和缓冲液

热稳定 DNA 聚合酶 [Hot-Tub DNA 聚合酶（Amersham) 或同类产品]
大多数 DNA 聚合酶保存在含 50% 甘油的贮存液中。这种溶液非常粘稠，很难准确取量。最简单的方法是在微型离心机上将含酶的离心管在 4°C 以最大转速离心 10s, 然后用一个可调式移液器取出所需数量的酶。用一个带屏障装置的自动移液器装配 PCR 反应成分。

凝胶

1% 的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶（含 0.5ug/ml 溴化乙锭）。

核酸和核苷酸

引物
将正向和反向内引物以 100umol/L(100pmole/ul) 的浓度溶解在水中。
将诱变引物以 10mmol/L(10pmole/ul) 浓度溶解在水中。

模板 DNA

通过溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心（第 1 章方案 10 或 11) 或用 Qiagen 树脂柱层析纯化超螺旋双链质粒 DNA(第 1 章方案 9)。将模板 DNA 以 0.1ug/ml 的浓度溶解在 TE(pH8.0) 溶液中。

专用设备

带屏障装置的自动移液器用吸头

微型离心机用离心管（扩增用 0.5 ml 薄壁管）

可调式移液器

可按所需扩增条件设定程序的热循环仪
如果热循环仪不配备加热盖装置，使用矿物油或石蜡油以防止 PCR 过程中反应混合物液体挥发。

其他试剂

本方案步骤 6 所需的试剂列在第 1 章方案 17 或 19 中。

方法

1. 使用 0.5 ml 微量离心管或扩增反应管（置冰上），混合下列第一轮扩增反应需要的

试剂：

10X 扩增缓冲液 10ul
质粒 DNA 模板 200~400pg
2.5 mmol/LdNTP 溶液 8ul
诱变引物 10pmoles
低 Tm 值侧引物 lOOpmoles
热稳定 DNA 聚合酶 0.5ul(2.5 单位）
加水至 100ul

如果厂商提供的热稳定 DNA 聚合酶 10x 扩增缓冲液中不含 MgCl2, 加入所需体积的 0.1mol/L MgCl₂，使反应混合物中含有 DNA 聚合酶反应最适浓度的二价离子。

2. 如果热循环仪没有加热盖，加入一滴石蜡油（约 50ul) 覆盖 PCR 反应。将反应管放置在热循环仪中。

3. 用下表中给出的变性、退火、聚合反应所需的时间和溫度扩增核酸


上述反应条件适合于 0.5 ml 薄壁管和 100ul 反应体积，在 Perkin-Elmer 9600 9700, Master Cycler(Eppendorf) 或 PTC.100 (MJ Research) 热循环仪上进行：使用其他类型的仪器或不同的反应体积时需调整上述反应条件。每1000bp 长的靶 DNA 聚合反应应进行 1 min。

4. 第一次 PCR 反应完成后再把下列成分加入到同一反应管中：

髙了 Tm 值的侧引物 100pmoles
热稳定 DNA 聚合酶 0.5ul(2.5 个单位）
2.5 mmol/LdNTP 溶液 3ul
用移液器温和的上下吸打几次混匀上述反应物。可离心几秒钟，将所有的试剂收集到离心管底部。
可以取 3~5ul 第一次 PCR 反应混合物，经琼脂糖凝胶电泳快速分析证实是否成功的合成了大引物 PCR 产物。

5. 接下来进行第二轮扩增反应，反应由 25 个循环和二步温度组成：

94°C,40S
72°C,90s 最后的延伸步骤为 72°C,5 min。

6. 取第二轮 PCR 扩增反应的 5% 进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，估计扩增出的靶 DNA 浓度。
如果引物内设置了限制酶位点，用相应的限制酶消化扩增 DNA, 然后次级克隆进适合的载体。也可以将步骤 5 磷酸化的扩增 DNA 连接至限制酶消化后产生纯端的质粒载体中。这种方法的诱变率大约为 80%, 通常仅需要挑选 6 个克隆进行 DNA 序列分析确认存在所希望的突变体，并肯定在 DNA 全序列中不存在其他的突变。