利用聚合酶链反应制备放射性标记的DNA探针

耐热的 DNA 聚合酶 模板 DNA

乙酸铵 扩增缓冲液 氯仿 乙醇 TE dCTP dNTP 溶液

屏障吸头 微量离心管 正向置换进样器 Sephadex G-50 离心柱 热循环仪

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙酸铵（10 mol/L)

10X 扩增缓冲液

用于乙醇沉淀放射性标记探针的载体

氯仿

乙醇

TE ( pH 7.6)

2. 酶与缓冲液

耐热的 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）

3. 核酸与寡核苷酸

dCTP ( 0.1 mmol/L）

含 dATP、dGTP 和 dTTP 各 10 mmol/L 的 dNTP 溶液

正向引物（20 μmol/L）及反向引物（20 μmol/L）（水配制）

模板 DNA（2~10 ng）

4. 放射性复合物

[α-³²P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 >3000 Ci/mmol）

5. 专用设备

自动微量进样器的屏障吸头

微量离心管（0.5 ml，PCR 专用的薄壁小管 )

正向置换进样器

Sephadex G-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡

热循环仪

二、方法

1. 在一个 0.5 ml 的薄壁微量离心管中设置下列扩增/放射性标记反应体系：

10X 扩增缓冲液                           5.0 μl

10 mmol/L dNTP 溶液                 1.0 μl 

0.1 mmol/L dCTP                        1.0 μl

20 μmol/L 正向寡核苷酸引物        2.5 μl

20 μM 反向寡核苷酸引物             2.5 μl 

模板 DNA ( 2~10 ng 或约 1 fmol)  5~10 μl

10 mCi/ml [α-³²P] dCTP

( 比活性 3000 Ci/mmol)               5.0 μl

水                                             加至 48 μl

在反应体系中加入 2.5 单位耐热 DNA 聚合酶。轻敲管壁以混合各组分。

2. 如果热循环仪无加热盖，可加一滴（50 μl）轻矿物油或一粒石蜡珠于反应混合物之上，以防止样品在反复加热及冷却的循环中蒸发。将微量管放入热循环仪。

3. 通过变性、复性和聚合扩增样品，反应时间见下表。



4. 从热循环仪中取出反应管，用微量移液器尽可能地从反应液上层吸去矿物油。用 50 μl 氯仿抽提反应液，以除去剩余的矿物油。室温下离心 1 min 以使液相与有机相分离。

5. 吸去上层水相，转移到一个清洁的微量管中，加入载体 tRNA ( 10~100 μg ) 或糖原 ( 5 μg），用等体积的 4 mol/L 乙酸铵和 2.5 体积的乙醇沉淀 DNA，放置于 -20℃ 1~2 h 或 -70℃ 10~20 min。4℃ 下以最大速度离心 5~10 min 收集沉淀的 DNA。

6. 将 DNA 溶于 20 μl TE ( pH 7.6)，用 Sephadex G-75 离心柱层析除去残存未掺入的 dNTP 和寡核苷酸引物。

7. 用液体闪烁计数仪测定 1.0 μl 离心柱外水体积的放射活性。贮存剩余的放射性标记 DNA 于 -20℃ 以备用。