利用血清筛选噬菌体文库PCR扩增的模板

　　[器材和试剂]
　　
　　●MicroAmp反应管（PerkinElmer）
　　
　　●洗脱缓冲液（20mmol/LTris—ClpH8．5，2mmol/LEDTA，1％TritonX—100）
　　
　　●GeneAmp9600PCR仪（PerkinElmer）
　　
　　●正向引物：5’—AGAGATTACGCCAAGCC—3’（7．5pmol）
　　
　　●反向引物：5’—TCCCAGTCACGACGT—3’（7．5pmol）
　　
　　●dNTP
　　
　　●NP—40（NonidetP—40）
　　
　　●Tag缓冲液（50mmol/LKCl，10mmol/LTris—ClpH8．3，1．5mmoI/LMgCl2，0，01％明胶）
　　
　　●Ampi-TaqDNA聚合酶（PerkinElmer）
　　
　　●LB—琼脂培养基+Amp板[LB—琼脂培养基，50ug/mlAmp）
　　
　　●SephacrilS—300（AmershamBiosciences）
　　
　　●SilentMonitorM膜底微孔板（ModelSMl20LP，1．2umLoprodyne；PallBioSupport）
　　
　　●真空过滤器（mod．EVENT4160，Ep—pendorf）
　　
　　[方法]
　　
　　1．用无菌塑料吸嘴挑取一个AmpR噬菌粒菌落（直径大约lmm）并将其转入到0．2mlMicroAmp反应管中，内含20u1洗脱缓冲液。在GeneAmp9600PCR仪中，95℃加热样本10分钟（避免用离心澄清，因为加热可使细胞碎片黏附在管底）。
　　
　　2．将菌落提取物作为该克隆的主拷贝保存。另外，这些菌落也可以直接转移到PCR反应体系中，并在PCR程序中插入加热步骤。此时，可将克隆主拷贝穿刺接种到在用UV灭菌并铺有LB—琼脂培养基+Amp的微板孔中。
　　
　　3．配置PCR反应体系：将3ul菌落提取物加入到一个0．2mlMicroAmpTM反应管中；反应管包含150nmol/L正链引物和反链引物、50mmol/LdNTP、0．5％NP-40、Taq缓冲液和1ulAmpllTagDNA聚合酶，终体积为50ul。按以下程序运行PCR反应：94℃10秒、60℃10秒、72℃10秒，共循环30次。
　　
　　4．在SilentMonitor膜底微板的各孔中，装入Sephacril“S-300的水性悬液，使每孔中含有400ul稳定床体积介质。用真空过滤器在板底形成真空状态，
　　
　　5．吸取各个克隆PCR扩增产物并加入到含有已抽干的Sephacril孔中。真空抽吸收集96孔板中的滤液（PCR扩增模板的大小决定了采用何种凝胶过滤介质：我们发现，SephacrilS-300对分离我们的300bpPCR扩增片段效果zui佳。按照上述流程，无论样本的处理或收集均比使用商业供应的装入微量离心管的旋转柱更加容易和快速，还节省材料成本）。
　　
　　6．用已纯化的PCR产物，按照标准实验方案进行测序。