利用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

实验概要

本实验用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化了外周血单个核细胞。

实验原理

常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是  1.077±0.001  的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400，000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

主要试剂

1. 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。
2. Hank's液(无Ca^２＋、Mg^２＋)
3. 10％小牛血清RPMI1640
4. 0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。
5. 肝素用Hank's液或生理盐水稀释成500单位／ml，人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。
试剂配制：

1. Hank's液(无Ca^２＋、Mg^２＋)配制法
　　　　NaCl 8.0克
　　　　KCl 0.4克

　　　　Na_２HPO_４·12H_２O 0.12克
　　　　KH_２HPO_４　　　　　　　　0.06克
　　　　葡萄糖　　　　　　　　　　1.0克
　　　　双蒸水　　　　　　　　　 1000毫克
　　　　1％酚红液　　　　　　　　　 2毫克

将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。

2. 细胞分层液配制法
　　　　9％聚蔗糖　　　　　　　　　24份
　　　　34％泛影葡胺　　　　　　　 10％
混合，测比重为1.077～1.078，G５玻璃滤器过滤除菌。４℃冰箱保存备用。

3. 磷酸缓冲液(PBS)
　　原液:
　　A液: 0.2M NaH_２PO_４溶液
　　　　 NaH_２PO_４　　　　　　　　　　27.6克
　　　　或NaH_２PO_４·2H_２O 　　　　　　31.2克
　　　　蒸馏水溶解至　　　　　　　　1000毫升
　　B液：0.2M Na_２HPO_４溶液
　　　　 Na_２HPO_４·12H_２O 　　　　　　71.6克
　　　　蒸馏水溶解至1000毫升　

各种不同PH值PBS的配法
───────────────────────────────────────
　PH　　　　　7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
───────────────────────────────────────
A液(ml)     39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B液(ml)     61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
───────────────────────────────────────
　　举例: 　0.1M 　PH7.2PBS
　　　　　　A液　　　28毫升
　　　　　　B液　　　72毫升
　　　　　加蒸馏水　 100ml

4. 血球保存液
　　葡萄糖　　2.05克　枸椽酸钠　　0.8克
　　氯化钠　　0.42克　蒸馏水　　 100毫升
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭菌。4℃保存备用。

5. RPMI-1640培养液:

　　　　RPMT-1640(FLOW公司出品)　　　　1袋
　　　　三蒸水　　　　　　　　　　　 1000毫升
电磁搅拌30分钟：1N　HCl调PH7.2～7.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验，4℃保存。
　　不完全RPMI-1640培养液:
　　　RPMI-1640　　　　　　　　　　　　　95毫升
　　　0.1M丙酮酸钠　　　　　　　　　　　　1毫升
　　 0.2M谷氨酰胺　　　　　　　　　　　　 1毫升
　　　1M　Hepes 1毫升
　　　7.5％ NaHCO_３ 1毫升
　　　青霉素、链霉素(各1万单位)　　　　　　1毫升
　　完全RPMI-1640培养液
　　　不完全1640培养液　　　　　　　　　　90毫升
　　　灭活胎牛(或新生牛)血清　　　　　　 10毫升

主要设备

1. 短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
2. 无菌干燥注射器针头。
3. 碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
4. 血球计数板、显微镜、水平式离心机。

实验材料

人外周静脉血

实验步骤

1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。

2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。

3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。

4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。

5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。

　　单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝
　　　　　　　　　4个大方格内细胞总数
　　　　　　　　　──────────　×　10４×2(稀释倍数)
　　　　　　　　　　　　　　4

6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
　　　　　　　　　　　　　活细胞数
　　　　　活细胞百分率＝──────　×100％
　　　　　　　　　　　　　总细胞数
用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。

注意事项

1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，应配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。