利用I型CRISPRCas系统实现大片段基因敲除

　　CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌中广泛存在的一种由RNA介导抵抗外援病毒或者核酸入侵的“获得性免疫系统”。CRISPR-Cas系统主要分为两大类：I类（Class I）利用多亚基效应复合物来实现对靶标序列的识别和切割过程；而II类（Class 2）则由单一蛋白来执行相关功能，作用机制相对简单【1】，其中Cas9, Cas12以及Cas13 已被开发成高效的基因编辑工具或者核酸检测工具，并被广泛应用。I类中的Type I系统是在细菌中分布最广泛的CRISPR-Cas，约占目前已发现CRISPR-Cas系统的近一半。以Type I系统中研究最为清楚的I-E亚型为例，该亚型对靶标DNA的识别依赖于一个由5个不同蛋白组成的超大复合物Cascade，对靶标DNA的切割则是由一个有解旋酶核酸酶双重功能的特征性蛋白Cas3来执行。只有当CRISPR RNA和靶标DNA完全互补配对（32 bp）且最终形成R-loop时，Cas3才会特异性地募集到Cascade上并被激活酶活性，进行长距离DNA降解【2】。尽管分布广泛且活性特殊，Type I甚至I类CRISPR-CAS系统的可应用性一直未能在任何真核系统中得到证明。

　　2019年4月8日，密歇根大学安娜堡分校张燕教授/侯仲刚博士研究组和康奈尔大学可爱龙教授研究组在 Molecular Cell 在线发表了题为Introducing a spectrum of long-range genomic deletions in human embryonic stem cells using Type I CRISPR-Cas 的最新合作研究成果。这一研究首次使用CRISPR Type Ⅰ型系统中的Cascade靶标识别复合物和Cas3解螺旋酶-核酸酶在人胚胎干细胞中成功实现高效率大片段基因敲除，为实现Cascade-Cas3在真核细胞中基因编辑的广泛应用奠定了基础。

　　在本项研究中，研究人员从嗜热单孢菌（Thermobifida fusca）来源的type I CRISPR-Cas系统入手，首先在Cas7和Cas3两个亚基上引入核定位序列（NLS），之后在大肠杆菌中表达纯化出Cascade复合物和Cas3蛋白，并利用电穿孔的方式直接导入到表达EGFP和tdTomato的人胚胎干细胞（hESC）的双重报告系统细胞中，解决了这一超大复合物的递送和入核问题。通过检测EGFP和tdTomato荧光信号, 证实Cascade和Cas3在人胚胎干细胞中的报告基因敲除效率可达到13％。通过长距离PCR和PCR产物测序证明这一结果完全是大片段基因敲除产生的，而非cascade结合引起的转录沉默。用相同的方法，在人类近单倍体细胞系HAP1中的内源基因HPRT1上，敲除效率高达到60%。有意思的是，由一种特定序列的CRISPR RNA可在人细胞中产生成千上万种不同的基因大片段缺失，均位于Cas3靶向位点的上游区域（即PAM，protospacer adjacent motif方向），且大小从几百bp到100 kb不等。这意味着由Cas3解螺旋酶核酸酶进行的DNA敲除，起始于靶标位点附近，而终止点则分布在靶向位点上游很广泛的区域。这些特征与定点局部编辑的cas9或cas12形成鲜明对比。

　　Cas3可以在基因组上进行远程位移的特点，是Cas9或Cas12所不具备的，因此type I CRISPR-Cas系统在引入远程表观遗传修饰方向会有广泛应用前景。此外，人类基因组中超过98％的序列是非编码区域，其中包括许多对基因调控和疾病的发生发展至关重要的顺式作用元件。然而用于筛选具有调控性功能的长片段非编码序列的遗传学工具仍然有限。Cascade/Cas3系统能够利用单个CRISPR RNA在靶向位点上游产生大范围片段缺失文库，这可以使得这种功能性筛选更加简单且成本更低。进一步筛选和改造type I CRISPR-Cas系统还可能被用于敲除大片段致病基因等等。基于Cascade/Cas3系统的基因编辑工具将极大地丰富基因敲除的研究手段。

　　1. Makarova, K.S., Wolf, Y.I., Alkhnbashi, O.S., Costa, F., Shah, S.A., Saunders, S.J., Barrangou, R., Brouns, S.J., Charpentier, E., Haft, D.H., et al. (2015). An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol. 13, 722–736.

　　2. Hochstrasser, M.L., Taylor, D.W., Bhat, P., Guegler, C.K., Sternberg, S.H., Nogales, E., and Doudna, J.A. (2014). CasA mediates Cas3-catalyzed target degradation during CRISPR RNA-guided interference. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, 6618–6623.