动物组织RNA提取及纯化

实验概要

提取样品组织中的RNA并消除DNA污染

实验原理

Trizol裂解细胞使RNA释放
beta巯基乙醇一直RNase活性
酚-氯仿抽提分离RNA
RNase-Free DNase消除DNA污染

主要试剂

Trizol
无水乙醇
氯仿（三氯甲烷）
异丙醇
RQ1 RNase-Free DNase（Promega，M6101）
液氮
RNase-Free water
醋酸钠缓冲溶液（3M，pH5.2）

主要设备

离心机
研钵
热块
离心机

实验材料

组织样品

实验步骤

组织中total RNA的提取

1. 取适量组织（约30mg）于研钵中加入液氮研磨，研碎后转移至EP管中；

2. 向样品中加入1mL Trizol，吹匀，放置5min；

3. 向上述EP管中加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min，4℃12000rpm离心15min；

4. 取上层水相500μL于新的EP管中（注意不要吸入沉淀），加入100μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min，4℃12000rpm离心15min；

5. 取上层水相400μL于新的EP管中（注意不要吸入沉淀），加入400μL异丙醇，室温放置10min，4℃12000rpm离心10min；

6. 弃上清，加入1mL 75%乙醇洗涤，轻弹混匀，4℃7500rpm离心5min；

7. 20μL RNase-Free Water溶解RNA；

8. 紫外测定RNA浓度，记录A260/280，，琼脂糖电泳鉴定RNA质量。

Total RNA中DNA的

DNA消化体系（100μL）

• RNA样品：10mg（量不足可适量减少）

• RQ1 DNase 10* Reaction Buffer：10μL

• 补水至100μL

1. 如体系加好样品，37℃孵育30min；

2. 向体系中加入100μl DEPC水；

3. 加入100μl氯仿，震荡混匀，室温放置10min；

4. 4℃13200rpm离心15min，吸取上层清夜150μl转移至新的EP管中；

5. 加入0.1倍体积（15μl）NaAc Buffer及等体积（150μl）异丙醇，室温沉降30min；

6. 4℃13200rpm离心15min，弃上清，75%乙醇洗涤沉淀；

7. 4℃12000rpm离心5min，弃上清，开盖放置晾干乙醇；

8. 20μl RNase-Free水溶解RNA；

9. 紫外测量浓度及A260/280，1.5%琼脂糖电泳检测RNA状态。

注意事项

所用工具均经高温灭菌
EP管、枪头经DEPC处理
实验地点尽量选择空气流动较少，实验时带口罩等。