动物细胞培养及外源基因导入的原理和操作步骤（二）

实验试剂

1. 细胞营养液（DMEM液体培养基，10％胎牛血清，双抗100单位/ml），消化液（0.05％胰酶，0.53mM EDTA·Na），Hank’s液。

2. 2×HBS液（280mMNaCl, 10mMKCl, 1.5mMNaHPO₄·2H₂O, 12mM葡萄糖，50mMHepes，pH7.05, 0.2μ过滤除菌），CaCl₂（2.5M，0.2μ过滤除菌）溶液，超纯水（灭菌）。

3. PBS，蛋白酶K，NP40，RNaseA，无水乙醇，酚/氯仿，DNA上样缓冲液，琼脂糖，TAE电泳缓冲液，EB。

实验设备

1. 10cm细胞培养皿

2. 50ml、15ml一次性离心管

3. 10ml玻璃吸管（灭菌），与玻璃吸管配套的吸球及胶管

4. 二氧化碳培养箱

5. 倒置显微镜

6. 20μl，200μl微量移液器

7. 1.5ml离心管（灭菌）

8. 200μl微量移液器头

9. 1ml微量移液器

10. 低速台式离心机

11. 高速台式离心机

12. 4°C，－20°C冰箱

13. DNA凝胶电泳设备

14. 紫外凝胶成像仪

实验材料

胚肾细胞系293，TNF－R1哺乳动物细胞表达质粒（CsCl超速离心纯），哺乳动物细胞表达载体（CsCl超速离心纯）。

实验步骤

1. 293细胞的传代培养（第一天） 
   

1) 显微镜观察母细胞的生长状态，确定传代比例。

为了获得较高的转染效率，必需保证细胞处于合适的生长密度，因此应根据母细胞的生长密度调整传代比例。磷酸钙转染的合适细胞密度为50％－70%，本实验中使用的293细胞长成致密单层后一般按照1：6传代即可。

2) 在酒精灯旁打开培养皿盖，倒去皿中的细胞营养液，加入2mlHank’s液，轻轻摇动，将溶液倒出。 

3) 消化与分装。 

在培养皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液），37°C静置5分钟左右，显微镜观察，如果细胞变圆且彼此分离表明消化完全，此时可加入10ml营养液终止消化，吹打数次，使培养皿壁上的细胞全部脱落下来，并分散形成均匀的细胞悬液。按照传代的比例补加适当体积的营养液，吹打混匀后分装到新的培养皿中。

在分装好的细胞培养皿上做好标记，置于37°C二氧化碳培养箱中培养。 

2. 用磷酸钙介导的外源质粒转染法在293细胞中过量表达TNF－R1（第二天） 

1) 显微镜观察待转染细胞的生长状态 

a. 观察细胞是否污染 

b. 观察培养液颜色的变化 

c. 观察细胞的生长密度 

2) 转染 

a. 用微量移液器在1.5ml离心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）质粒DNA（实验组为TNF-R1的哺乳动物细胞表达载体，对照组为空载体），350μl超纯水，40μlCaCl2(2.5M)溶液，混匀。 

b. 在另一1.5ml离心管中加入400μl2×HBS，将A液分三次缓慢加入，每次加入A液后用吹气泡的方法混匀。室温静置5分钟。 

c. 将A，B混合液均匀地滴加在待转染的293细胞培养液中，轻轻晃动使混匀。将培养皿置于37°C二氧化碳培养箱中。 

3. 凋亡细胞的形态观察，“DNA Ladder”的提取及琼脂糖电泳分析（第三天） 

1) 显微镜观察过量表达TNF-R1（实验组）和空载体（对照组）的293细胞形态上的差异。 

2) 用10ml玻璃吸管将实验组和对照组培养皿中的细胞轻轻吹打下来，收集到15ml离心管中，2000rpm离心5分钟，沉淀用1mlPBS重悬，转移到1.5ml离心管中，2000rpm离心3分钟，去除上清液，加入200μlPBS(0.2mg/ml 蛋白酶 K)，重悬细胞，再加入200μlPBS（2％NP40），颠倒混匀，4°C作用30分钟，期间颠倒数次。12,000rpm离心2分钟，吸出上清，加入1ml乙醇，颠倒混匀，－20°C静置10分钟，12,000rpm离心10分钟，沉淀溶于50μl水中，加入RNaseA(10mg/ml)，37°C静置20分钟。 

3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上样缓冲液，取出50μl进行2％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪拍照。