动物细胞基因组DNA的制备

实验概要

本实验介绍了动物细胞基因组DNA的制备原理及操作流程。本方法一般可从5×10⁷培养的非整倍体细胞（如HeLa细胞）中获得大约200μg DNA。DNA的长度可达到100~150kb。20ml正常血的DNA产量约为250μg。

实验原理

真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组   DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中DNase的活性；蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
从核酸样品中去除蛋白质常用等体积平衡酚和氯仿：异戊醇（24：1）组成的混合物。其中氯仿可使蛋白质变性并有助于水相和有机相的分离，异戊醇有助于减少抽提过程中泡沫的形成。平衡酚的pH应在7.8以上，否则DNA会进入有机相。

主要试剂

1. PBS溶液：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄。配制：用800ml 水溶解8g NaCl，0.2g KCl，3.22g Na₂HPO₄·12H₂O，0.24g KH₂PO₄；用HCl将pH调至7.4；定容至1000 ml。高压灭菌或过滤除菌，室温保存。
2. STE溶液：0.15 M NaCl，10 mM Tris-HCl （pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。高压灭菌。
3. 20% SDS：900ml水溶解200g电泳级SDS。加热到68°C并用磁力搅拌器搅拌助溶。如果需要，加几滴浓HCl调解pH为7.2。用水定容到1000ml。室温保存，无须灭菌。
4. 蛋白酶K溶液（20mg/ml）：20mg蛋白酶K溶于1ml灭菌ddH₂O中，分装-20℃保存。该储备液在-20℃可稳定保存一年。
5. TE缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA。高压灭菌。
6. 平衡酚：用0.5M Tris-HCl，pH8.0平衡。pH必须大约为8。
7. “酚/氯仿/异戊醇”溶液：25ml平衡酚, 24ml氯仿、1ml异戊醇混合。混合物上覆盖一层100mM Tris-HCl（pH8.0）缓冲液，在不透光的瓶子中4℃保存1月。
8. 冷无水乙醇：-20℃贮存的分析纯无水乙醇。
9. 10M 乙酸铵（NH₄Ac）：70ml水溶解77g乙酸铵，用水定容到100ml。用0.22μm滤器过滤除菌。密闭瓶中室温保存。
10. 70%乙醇：用水稀释无水乙醇配制。
11. ACD抗凝剂（用于新鲜血样抽取或冻存血样）：0.48% （m/V）柠檬酸，1.32% （m/V）柠檬酸钠，1.47%（m/V）葡萄糖。

主要设备

1. 磁力搅拌器

2. 高压灭菌锅

3. 10ml注射器

4. 高速离心机

5. 低温冰箱

6. 大口径吸头

实验材料

哺乳动物培养细胞

实验步骤

1. 收获哺乳动物培养细胞
   1) 用胰酶消化收集单层培养细胞或离心收集悬浮培养细胞。
   2) 用PBS溶液重悬细胞，4℃ 2500rpm离心10 min。吸弃PBS溶液。
   3) 用TE缓冲液将细胞重悬至浓度为5×10⁷细胞/ml。
2. 获取鱼血液细胞
   1) 取一10ml注射器，吸入0.5ml ACD抗凝剂（ACD抗凝剂：血液=1:5）。
   2) 尾静脉抽血，血液经ACD抗凝，置4℃冰箱。
   3) 血液在4℃静置4h后，血细胞沉积。沉积的血细胞可立即用于DNA制备，或50μl分装，-20℃短期保存或-80℃长期保存。
3. 取50μl TE细胞悬液或50μl沉积的鱼血细胞，加入450 μl STE溶液，10μl 20% SDS（终浓度0.5％）和10 μl 20mg/mL蛋白酶K（终浓度400 μg/mL），轻轻颠倒混匀，55℃水浴消化3h或过夜。
4. 将溶液冷却到室温，加入等体积平衡酚，缓慢颠倒混合10min，12000rpm 离心15min。
5. 用大口径吸头（出口直径为7.5px）将粘稠水相转移到新离心管中。
6. 水相中加入等体积平衡酚，缓慢来回颠倒试管10min，12000rpm离心10min；用大口径吸头将粘稠水相转移到新离心管中。
7. 水相中加入等体积“酚/氯仿/异戊醇”溶液，缓慢来回颠倒试管10min，12000rpm离心10min；用大口径吸头将粘稠水相转移到新离心管中。
8. 重复“酚/氯仿/异戊醇”抽提1次。用大口径吸头将粘稠水相转移到新离心管中。
9. 水相中加入等体积氯仿溶液，缓慢来回颠倒试管10min，12000rpm离心10min；用大口径吸头将粘稠水相转移到新离心管中。
10. 转移水相转移到新离心管中，加入0.2体积的10M 乙酸铵和2倍体积室温无水乙醇（若使用冰冷乙醇，会让一些残留的RNA也沉淀出来。），水平旋转或轻缓反转离心管，使溶液充分混匀，DNA会形成丝状析出物。
11. 12000rpm离心10min，沉淀DNA。吸弃上清。
12. DNA沉淀中加入500μl 70%乙醇，颠倒试管使溶液充分接触试管所有内壁，以洗去残留的盐。
13. 12000rpm离心10min，沉淀DNA。吸弃上清。
14. 敞开管口，使乙醇挥发干净。
15. 依据DNA团块的大小，加入50~200μl TE缓冲液，溶解DNA（45~55℃保温有助于DNA溶解。DNA样品也可以4℃过夜溶解。）。

注意事项

1. 室温下使乙醇尽可能挥发干净，但不要使DNA太干燥，否则极难溶解。

2. DNA溶液短期使用可在4℃存放，长期储存应分装后保存在-20℃或-80℃，但要避免反复冻融。