动物肝脏RNA的制备(苯酚法)和纯度测定1

原理
细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此分离RNA时必须使RNA与蛋白质解离，并除去蛋白质。除去蛋白质的方法主要有：（1）用氯仿－辛醇混合液剧烈振荡，使蛋白质变性。（2）在冷的2mol/L盐酸胍溶液中沉淀RNA，大部分蛋白质仍处于溶解状态。（3）以去污剂如十二烷基硫酸钠（SDS）处理，使核蛋白解离，蛋白质变性。（4）以含水的酚溶液除去蛋白质。去污剂和酚均能抑制RNA酶活力，有利于制备核酸大分子。目前应用最广的是苯酚法。
以酚水两相系统分离RNA是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲盐溶液中，加等体积水饱和的酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被酚变性的蛋白质或溶于酚相、或在两相界面处形成凝胶层。实验所用的0.15mol/L缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核蛋白解离，在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条件下，从水相中除去，这样得到的RNA制品中混杂的DNA量极低。RNA制品继续用氯仿－异戊醇处理，可以进一步除去其中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉淀下来。

实验所得制品的核酸含量可用紫外吸收法和定磷法测定，然后用地衣酚显色法测定RNA含量，二苯胺显色法测定DNA含量，Folin－酚试剂法测定蛋白质含量。

操作方法
取2g动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚液，室温下剧烈振荡10分钟。置冰浴中分层，在0-4℃下，以4000rpmn离心15分钟。吸出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈振荡10分钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加2倍体积2%乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。
将RNA（准确称取30mg左右RNA干燥制品）溶于5～10mL蒸馏水中，离心除去不溶性杂质，测定上清液中蛋白质含量（Folin－酚试剂法见本学期实验二），核酸含量（见本实验[附1]、[附2]、[附3]、[附4]）。
试剂和器材
试剂
1.SDS-缓冲盐溶液［0.3%SDS-0.1mol/L氯化钠-0.05mol/L，pH5.0乙酸盐缓冲液］称取1.5gSDS，2.92g氯化钠，2.05g乙酸钠溶于水中，用乙酸调至pH5.0，最后定容至500ml。
2.含水酚液：使用前将苯酚重蒸(酚的沸点为181.8℃)并用SDS－缓冲盐溶液使其饱和。
3.氯仿-异戊醇液：氯仿：异戊醇=24:1(V/V)。
4.含2%乙酸钾的95%乙醇溶液。
5.75%乙醇，95%乙醇、无水乙醇。
6.乙醚
7.测定用试剂见本实验［附1］、［附2］、［附3］、［附4］。

器材
1.剪刀、镊子 2.乳钵 3.磨口具塞锥形瓶(500ml)
4.天平 5.离心机(4000rpm) 6.动物肝脏
［附1］紫外吸收法测定核酸含量
原理
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数(或称吸收系数)用κ(P)260nm来表示，κ(P)260nm为每L溶液中含有1摩尔核酸磷的光吸收值。RNA的κ(P)260nm (pH7为7700~7800)。RNA的含磷量约为9.5%，因此每mL溶液含1μg RNA的光吸收值相当于0.022~0.024。小牛胸腺DNA钠盐的κ(P)260nm(pH7)为6600，含磷量为9.2%，因此每mL溶液含1μg DNA的钠盐光吸收值为0.020。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。

操作方法

将样品配制成每mL含5~50μg核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm和280nm吸收值，计算核酸浓度和两者吸收比值。

A260nm式中： 为260nm波长处光吸收读数；L为比色池的厚度一般为1或0.5cm;0.024为每mL溶液内含1µg RNA的光吸收；0.020为每mL溶液内含1µgDNA钠盐时的光吸收值。

 [附2]二苯胺显色法测定DNA含量

原理
脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大光吸收。 DNA在40-400µg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除DNA外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。
操作方法
一、DNA标准曲线的制定
取10支试管，分成2组，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mLDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成2mL。另取2支试管，各加2mL蒸馏水作为对照。然后各加入4mL二苯胺试剂，摇匀。于60℃恒温水浴中保温1小时，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
二、制品的测定
取2支试管，各加2mL待测液（内含 DNA应在标准曲线的可测范围之内）和4mL二苯胺试剂，摇匀。其余操作同标准曲线的制作。
三、DNA含量的计算
根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收值DNA的含量，按下式计算出制品中DNA的百分含量：