单克隆抗体制备

1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠
 
2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
 
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。每次免疫使用50-100µg免疫原。
 
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/8的免疫原。接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
 
5. 第0星期 预采血
 
完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
 
第2星期
 
完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
 
第3星期
 
不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
 
第4星期
 
溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
 
第5星期
 
取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，
 
溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
 
第X星期
 
取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，
 
溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
 
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。ELISA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
 
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。

8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。