单克隆抗体细胞的选择

实验概要

本文介绍了单克隆抗体细胞的选择实验。

实验原理

在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞(Feeder cell)。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C₅₇鼠，昆明小白鼠等。

实验步骤

脾细胞：

1. 材料

   1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。

   2) 1640培养液。

   3) 2.5％FCS－1640营养液。

2. 操作方法

   1) 拉颈或用CO₂处死小白鼠。

   2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。

   3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。

   4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。

   5) 直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。

   6) 以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min(与此同时应开始制备骨髓细胞)。

   7) 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。

   8) 重复6、7步骤。

   9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

饲养细胞：

1. 材料

   1) 小鼠(Balb/c或C₅₇小白鼠)若干只。

   2) 11.6％蔗糖溶液(经10磅30min高压灭菌)。

2. 操作方法

   1) 拉颈处死小鼠。

   2) 70％酒精浸泡消毒10min。

   3) 用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。

   4) 用注射器将4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。

   5) 1000r／min离心10min。

   6) 取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。

   7) 以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO₂培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。