10分钟生成分割,AI可进行更精确、快速的细胞器定量分析

冷冻软 X 射线断层扫描 (Cryo-SXT) 是研究细胞超微结构的强大方法，可提供数十纳米范围的分辨率和膜结构的强烈对比度，无需标记或化学固定。较短的采集时间和相对较大的视场导致快速采集大量断层图像数据。将这些数据分割成可访问的特征是从低温软 X 射线断层扫描中获取生物学相关信息的必要步骤。然而，手动图像分割仍然需要比数据采集多几个数量级的时间。

　　为了克服这个问题，由柏林自由大学计算机科学家 Frank Noé 博士教授和细胞生物学家 Helge Ewers 博士教授领导的团队与柏林亥姆霍兹材料与能源中心（HZB）的 X 射线显微镜部门合作，开发了一种基于半监督深度学习的端到端自动化 3D 分割管道。该方法适用于大量断层扫描数据的高通量分析，同时在面对有限的手动注释和断层扫描条件的变化时也具有稳健性。

　　该研究以「3D surface reconstruction of cellular cryo-soft X-ray microscopy tomograms using semisupervised deep learning」为题，于 2023 年 6 月 5 日发布在《PNAS》。

　　所有细胞都充满了致密而复杂的细胞器和大分子结构混合物，它们依靠纳米级相互作用来执行重要功能。为了了解细胞器的组织和相互作用，以天然细胞超微结构的分辨率收集信息至关重要。电子显微镜（EM）被认为是超微结构分析的黄金标准。然而，虽然目前科学家对细胞过程的理解很大一部分是基于 EM 方法，但样品制备、体积覆盖、采集速度和通量方面仍然存在一些限制。与 EM 方法相比，冷冻软 X 射线断层扫描（Cryo-SXT）具有多种优势，但分辨率稍低。

　　关于 Cryo-SXT

　　Cryo-SXT 利用元素固有的不同吸收对比度。在称为「水窗口」的光谱区域，与氧原子相比，碳原子的吸收非常强烈。这对于生物样本具有重要意义，可以利用蛋白质和脂质等碳致密材料与水环境之间的自然对比，以 30 至 40 nm 的分辨率可视化膜细胞器和小颗粒。此外，特定的细胞器或结构可以根据其线性吸收系数来区分，这与其化学成分直接相关。

　　与许多 EM 方法不同，Cryo-SXT 样品既不需要化学固定，也不需要包埋或标记。相反，细胞可以在金透射电子显微镜 (TEM) 网格上生长，冷冻并直接在透射 X 射线显微镜中成像。此外，软 X 射线的穿透深度为 15 µm，明显比 TEM 技术所能达到的深度更深。这允许在几分钟内对整个细胞体积进行透射显微镜和断层扫描，而不需要物理切片。

　　使用 Cryo-SXT，可以在不到30分钟内获得覆盖~1000 µm^3的断层图像。这使得可以利用 3D 体积中统计相关的数据量（如酵母细胞周期、纳米颗粒摄取和寄生虫感染）来研究细胞器组织的变化。

　　此外，Cryo-SXT 与冷冻荧光显微镜或冷冻硬 X 射线荧光显微镜的兼容性，有助于特定细胞结构和过程的识别和可视化。虽然在 Cryo-SXT 中可以相当快地生成体积数据，但数据分析仍然非常耗时。使用机器学习算法的自动或半自动分割有望克服这一障碍。

　　固有的挑战

　　适用于 Cryo-SXT 断层图自动分割的方法的设计是一项持续的工作，并面临着固有的挑战，例如有限的焦深和缺失的楔块问题。使用传统深度学习图像处理来应对这些挑战需要大量一致、高质量的训练数据，这反过来又需要广泛访问合适的低温软 X 射线显微镜，并需要大量的手动工作来构建合适的训练数据集。

　　专注于自动图像分割任务，深度卷积网络（ConvNet）的监督学习仍然是最流行的方法。但是，完全依赖卷积网络的监督学习需要大量的手动注释数据。此外，在监督训练中，网络可能会过度拟合用于获取训练数据的仪器，并且无法推广到不同的成像源。

　　用于 Cryo-SXT 图像分割的半监督学习方法

　　为了应对这些挑战，同时受益于 ConvNet 的性能和易用性，柏林自由大学团队引入了一种用于 Cryo-SXT 图像分割的半监督学习方法。他们提出了一种深度卷积模型，它将完善的 U-Net 架构与图像重建路径相结合，并使用手动注释和未注释图像的混合进行训练。

　从原始倾斜数据到 Cryo-SXT 数据集的 3D 体积渲染的处理工作流程

　　虽然网络通过手动注释学习对感兴趣的特征（例如膜结构）进行分类，但大量未注释的数据使其能够学习各种可能的图像特征和成像条件的表示。这种方法显著增强了网络对输入可变性的理解，同时减少了做出可靠预测所需的注释图像的数量。一旦对带注释和未注释的数据进行训练，就可以实现来自不同仪器的各种cryo-SXT断层图的零样本分割和表面重建，而无需参数调整和重新训练。

　　虽然表面重建可以快速目视检查数据集中捕获的细胞结构，但自动分割可以更快地定量评估数据。整个应用程序流程需要几分钟的时间才能完成全细胞断层扫描，从而提供了一种多功能工具来充分利用低温软 X 射线断层扫描数据集中的结构信息。研究人员在三个不同同步加速器获取的未见数据上测试他们的模型，以证明可转移性并量化大量的次分辨率 3D 数据，从而证明该技术的吞吐量。

　　新方法的几个关键优势

　　1、使用该网络，可以在 GPU 上在不到 10 分钟的时间内生成分割。这极大地简化并加速了数据分析步骤，使得在采集断层图像期间就可以在同步加速器上分析数据。这不仅节省了大量时间，而且使研究人员能够更快地从数据中学习，并可能在获取下一个数据集之前调整关键样本参数，从而提高他们获得的数据的质量。这一点尤其重要，因为 Cryo-SXT 主要适用于同步加速器，而同步加速器仅允许有限的射束时间。

　　2、获得数据 3D 分割所需的手动输入显著减少，从而节省时间并提供更客观的分割结果。对数据集进行完整分割所需的时间相当长，因此用户可能只将分割工作集中在数据的一部分上，以寻找预期的结果。公正的自动分割有助于揭示实验条件下细胞中更微妙或意想不到的变化。同时，可以在合理的时间范围内生成统计相关的数据量。这使得能够充分利用 Cryo-SXT 的全部潜力，不加区别地可视化所有碳密集的细胞结构，例如膜和细胞骨架结构。

　　3、该神经网络可以使用新的训练数据进行重新训练。这应该可以提高网络在特定断层扫描重建条件下的性能，或者在研究贴壁哺乳动物细胞以外的不同细胞类型时的性能。由于处理速度快、精度高，基于初步分割生成大量训练数据比手动分割相当数量的数据要快得多。

　　4、网络的输出数据可以导出为常见文件格式，包括 TIFF 格式，因此可以轻松导入到生物学家常用的各种程序中，例如FIJI或显微镜图像浏览器（MIB）。这确保了更轻松地集成到用户的个人图像处理和分析工作流程中。

　　结语

　　HZB 的 X 射线显微镜专家 Stephan Werner 博士表示：「在这项研究中，我们使用来自具有所谓丝状伪足的细胞培养物的哺乳动物细胞，展示了基于人工智能的细胞体积分析的效果。」 哺乳动物细胞具有复杂的结构，具有许多不同的细胞器，每个细胞器必须履行不同的细胞功能。丝状伪足是细胞膜的突起，特别用于细胞迁移。

　　「对于冷冻 X 射线显微镜，细胞样本首先被急速冷冻，速度如此之快，以至于细胞内不会形成冰晶。这使得细胞处于几乎自然的状态，使我们能够研究细胞内外部因素的结构影响。」Werner 解释道。

　　「我们的工作已经引起了专家们的极大兴趣。」文章的第一作者 Michael Dyhr 说。神经网络在很短的时间内正确识别了大约 70% 的现有细胞特征，从而能够非常快速地评估数据集。Dyhr 说：「将来，我们可以使用这种新的分析方法来研究细胞如何对纳米颗粒、病毒或致癌物等环境影响做出反应，比以前更快、更可靠。」