单分子测序助力细菌甲基化组的分析

　　New England Biolabs联合Pacific Biosciences的研究人员利用PacBio RS系统对6种细菌基因组进行了重测序，不仅鉴定出细菌基因组中新的胞嘧啶和腺嘌呤甲基化位点，还鉴定出介导这些表观遗传学标志的甲基转移酶。该研究成果近日发表在《Nucleic Acids Research》上。

　　近年来，甲基化研究持续升温。在哺乳动物中，研究的热点从第五种碱基5-mC一直延续到5-hmC、5-fC和5-caC。在细菌基因组中，N6- 甲基腺嘌呤(m6A)和N4-甲基胞嘧啶(m4C)也很常见，它们作为限制修饰(RM)系统的一部分而行使功能。然而，因缺乏定位这些甲基化的简单方法，它们常常被忽略。直到单分子实时(SMRT)测序技术的出现，这些甲基化修饰的鉴定才变得很简单。

　　在这项研究中，New England Biolabs(NEB)联合PacBio的研究人员对6种细菌基因组进行了重测序。这6种细菌分别为：Geobacter metallireducens、Chromohalobacter salexigens、Vibrio breoganii、Bacillus cereus，以及空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的两个亚种。这些细菌之前也在其他平台上测序过，但这次是利用PacBio RS系统来特异分析其甲基化组。

　　细菌基因组中的甲基化碱基作为限制修饰系统的一部分发挥着重要功能，它们保护宿主不受其他限制性内切酶的有害作用。然而，在一些情况下，这些甲基转移酶(MTase)还发挥调控作用，引入m6A残基，在DNA修复中发挥作用。

　　研究人员之前将单个MTase基因克隆到质粒上，并在甲基化缺陷型大肠杆菌菌株中增殖，以分析其识别位点，然而，质粒研究的结果不是很明确。因此，研究人员考虑用SMRT测序方法来直接分析细菌基因组，从而获得甲基化程度的准确估计。

　　通过这种方法，研究人员在细菌基因组中发现了多个新的N6-甲基腺嘌呤(m6A)和N4-甲基胞嘧啶(m4C)甲基化模式，并指定了负责那些甲基化模式的DNA甲基转移酶。

　　作者认为，SMRT测序能为基因组中存在的活性MTase提供功能信息，并破译它们的识别序列。这种方法，以及它所带来的长读取，是现有高通量测序平台的一个很好辅助手段，便于序列组装，并可靠记录基因功能。