单拷贝基因组探针及染色体彩绘方法进行荧光原位杂交

SSC D-PBSA 糖原 RNase 多聚甲醛 甲酰胺

固定液 乙醇 杂交缓冲液 标记探针 橡胶乳黏剂 封固剂

含有重复序列探针的沉淀：

大分子量黏粒探针往往含有重复序列，如果在杂交前不能封闭这些序列，将导致严重的非特异性杂交背景。人 Cot1 DNA 富含重复序列，可对黏粒的重复序列产生竞争性抑制，故杂交中加入 Cot1 DNA 可消除上述影响。在下述的操作步骤（b  )中，可将 Cot1 DNA 一并沉淀。

(a) 就20 μl 的缺口平移标记反应体系而言，取 0.5，mol/L EDTA 1 μl，4 mol/L LiCl 2.5 μl，糖原 1 μl，100~1000 倍过量的人 Cot1 DNA ( Invitrogen ) 及乙醇 100 μl，与标记探针混合。

(b) 将其置于干冰上 30 min 或 -20 ℃ 过夜，使之沉淀。

(c) 在离心机中离心 15 min，以沉淀 DNA 。

(d) 用 70 % 乙醇洗涤沉淀。

(e) 离心使 DNA 再沉淀，室温晾干 DNA 。

(f) 以杂交缓冲液中重新稀释 DNA，浓度为 2~10 ng/μl。

不含重复序列探针的沉淀：

与前述方法基木相同，但需要将 Cot1 DNA 从沉淀中去除。

探针变性：

(a) 对于含有重复序列的探针，需要用 Cot1 DNA 将其封闭。将探针混合液加热至 70°C 10 min。将探针混合液 37°C 放置 1 h，然后涂在载玻片上。

(b) 对于不含重复序列的探针，将探针混合液加热至 70°C 10 min，然后将其在冰上冷却 10 min。

检测探针的 TBST 缓冲液，含 0.05% Tween20 ( 吐温），以 0.1 mol/ L Tris，0.15 mol/L NaCl ( pH 7.5 ) 配制

甲酰胺，以1X SSC 配成 50%

抗体：

(a) 第一抗体（一抗），如：抗地高辛或抗生物素的羊多抗血清；滴定法参见产品说明（Roche)

(b) 第二抗体（二抗），如：FITC-耦联的驴抗羊 IgG (JacksonlmmunoresearchInc.)

(c) 用含 3% 牛血清白蛋白（BSA ) 的 TBST 稀释抗体

染色体的制备与变性：

1. 用规范技术制备中期静止细胞（见方案16. 7 及方案27. 5)，将固定的细胞滴至载玻片上，用钻石刻笔做好区域标记。

2. 用新配制的甲醇及乙酸（3 : 1 ) 固定液再次固定细胞 1 h，然后晾干载玻片。

3. 于室温下用 2X SSC 淋洗玻片 2 min。

4. 于 37°C 条件下，用含 100 μg/ml RNase 的 2X SSC 温育 1 h。

5. 用 D-PBSA 淋洗。

6. 室温下用新制备的含 1 % 多聚甲醛的 D-PBSA 再固定 10 min (此过程为可选步骤）。

7. 用 D-PBSA 淋洗。

8. 用 70 % 和 100% 乙醇进行两轮脱水，每次 2 min，然后风干载玻片。

9. 于 70°C 条件下，用含 70 % 甲酰胺 2X SSC 变性染色体 2~4 min (从 2 min 开始尝试，以确定实验的适宜时间），在使用 70% 甲酰胺前先确信其温度为 70°C。

10. 用冰冷的 70% 乙醇分次淋洗玻片。

11. 重复步骤 8 中的脱水操作，并且晾干玻片。

12. 此时的染色体可用于杂交反应。

杂交：

13. 在铺布细胞的区域内滴加 10 μl 变性探针（标记探针：大分子量的黏粒克隆很适于作为检测单拷贝基因的探针，但 cDNA 探针同样可以使用。采用商品试剂盒，将 DNA 用缺口平移法标。Roche (以前是BoehringerMamiheim) 生产的缺门平移试剂盒可用于生物素或地高辛掺人，详情可参照产品说明。），用 22mm X 22 mm 的盖玻片覆盖此区域。

14. 用橡胶乳黏剂将盖玻片四周封闭住。

15. 载玻片在 37°C 饱和湿度的孵箱中过夜。

探针检测：

16. 次日取出载玻片，浸入 2X SSC 中，揭去盖玻片（室温下），清除外周的胶黏剂，将载玻片置于一个 Coplin 瓶中。

17. 42°C 条件下，用含 50 % 甲酰胺的 1X SSC 浸泡载玻片 2 次，每次 10 min。

18. 42°C 条件下，用 2X SSC 液淋洗载玻片2 次，每次 10 min。

19. 用 TBST 淋洗。

20. 37°C 条件下，将载玻片在含 3% 牛血清白蛋白的 TBST 中孵育 30~60 min，以封闭非特异性结合。

21. 将一抗（第一抗体）滴加到载玻片上，每个载玻片用 100 μl 抗体，用 Parafilm 封盖每个载玻片。

22. 37°C 条件下，孵育载玻片 1 h。

23. 室温下，用 500 ml TEST 淋洗载玻片。

24. 将 3%  BSA/TBST 稀释的荧光素耦联二抗液滴加到载玻片上，二抗的使用效价（滴度）参见产品说明或者自己摸索。

25. 37°C 条件下，孵育 30 min。

26. 室温下用 500 ml TBST 淋洗 30 min。

27. 用含 0.8 μg/ml 的二氨基苯基吲哚（DAPI ) 和（或）含 0.4 μg/ml 碘化丙锭(PI) 的 TBST 复染 10 min，用抗消色玻片封盖。

28. 通过相应的滤片组合，用荧光显微镜观察载玻片上的细胞。

抗体的组合使用一定要正确， 例如：如果使用抗地高辛的羊多抗血清作为第一抗体， 那么第二抗体就必须是 FITC -耦联的驴抗羊 IgG 抗体。