单核苷酸多态性（SNPs）鲑鱼基因型的高通量分析

在美国阿拉斯加州，对于鲑鱼产业的良好管理具有极大的经济价值。单核苷酸多态性基因分析在卫生保健领域已有广泛应用，但在农业生物领域并不多见。本文阐述了单核苷酸多态性基因型检测在阿拉斯加的渔场管理者维持健康野生太平洋鲑鱼数量方面的应用。

For the state of Alaska, good management of salmon fisheries is of enormous economic importance. SNP genotyping is usually encountered in the field of health care, not in the area of AgBio, but the applications of SNP genotyping assays are helping Alaska’s fishery managers maintain robust populations of wild Pacific salmon.

        美国阿拉斯加州是世界上最佳的渔场之一，大量生产味道鲜美、益于健康的野生鲑鱼。为了帮助阿拉斯加渔场管理者维持健康鲑鱼的数量，阿拉斯加渔政部（ADF＆G）投资，从美国应用生物系统公司（Foster City, CA）引进了自动化基因分析技术。在阿拉斯加渔政部基因保护（gene conservation）的实验室里，一群科学家和技术人员在首席科学家James Seeb 博士的指导下，为坐落于阿拉斯加湾的多个渔场进行鱼群组成和迁徙的研究。利用从应用生物系统公司购买的高通量TaqManR单核苷酸多态性（SNPs）基因检测仪和实时多聚酶链式反应（PCR）系统，Seeb 博士领导的研究小组帮助渔场管理者们维持健康野生的太平洋鲑鱼的数量。

　　利用高通量SNP 基因检测仪，阿拉斯加渔政部的科学家可以对更多的鱼进行检测以获得其基因序列，从而为渔场管理者提供更多具有重要商业价值的关于鲑鱼种群组成和迁徙模式的信息。利用这些信息，渔场管理者可以预测不同捕捞区内鱼群的组成、鱼苗成长过程中的迁徙路线以及评估环境对鱼群数量的影响。

　　通常捕捞的鲑鱼鱼群由不同种类的鲑鱼组成。每种鲑鱼可能来自于许多不同的河域，数目也不尽相同。当鱼群数量不足时往往需要暂时对其进行保护，例如成功地管理渔场或将鱼群混聚在一起保护单股鱼群，使之免受自然力和人类的危害。

1 鲑鱼种类的多样性

　　在美国阿拉斯加州，有5 种太平洋鲑鱼：红鲑、狗鲑、国王鲑，粉红鲑和银鲑。它们不仅是生态系统的基本成员，也是阿拉斯加州渔业的主要产品。实际上，阿拉斯加州宪法中有一项条款要求每年需将一定数量的鲑鱼放回淡水产卵区产卵（见图1 和图2 ）。

　　虽然粉红鲑的年产量占阿拉斯加州鲑鱼年产量的6 0 ％以上，但它们主要是被加工成廉价的罐装鱼制品。红鲑的平均产量占阿拉斯加州鲑鱼产量的22％，狗鲑占11％。与之不同的是，国王鲑年产量只有鲑鱼总量的3 ％。因此，更为稀少的野生国王鲑在鱼产品市场售价高达每镑15 美元也丝毫不会令人感到惊讶。与之相比，养殖的大西洋鲑鱼售价仅为每镑6美元。

　　狗鲑在所有太平洋鲑鱼中分布范围最广，由西太平洋的韩国海域开始，贯穿阿拉斯加海湾直至美国西北的太平洋海域都可以找到。据Seeb 博士介绍，世界上所有的狗鲑都沿着阿拉斯加半岛南海岸进行迁徙，该区域有一条海峡将阿拉斯加湾和白令海连接在一起。尽管对渔民而言，狗鲑并不如国王鲑和红鲑珍贵，但它却是许多阿拉斯加本土人生活中必不可少的食品[1 ]。

2 捕鱼区域的管理

　　鲑鱼卵在淡水河流进行孵化，产生的鱼苗会向海洋迁徙，成鱼最终再返回其聚居的河流中产卵。可以通过分子标签对某一鱼群游经的路线进行标记，并借助这种方法对鲑鱼种群的迁徙路线绘图研究。

　　了解鲑鱼在哪里出现、以及何时出现可以帮助渔场管理者更清楚地知道为什么某种鲑鱼被捕获的频率远高于其他种类。例如，一种鲑鱼迁徙到目的河流的距离往往决定了其被捕捞的几率。利用基因分析技术，Seeb 博士领导的研究小组为这些管理者提供不同捕鱼区内捕获的鱼群中鲑鱼的种类分布数据。

　　阿拉斯加渔政部所属的商贸渔业部负责控制市场销售所需的鲑鱼捕捞量。Seeb 博士的实验室受其邀请为渔业管理者做报告，内容包括用于区分不同鱼种的基因分析数据。

　　Seeb博士实验室的研究人员从鲑鱼DNA样本中获得等位基因出现频率的数据，并用这些数据鉴定渔场捕捞到的鱼群状况。阿拉斯加渔政部根据渔场提供的鲑鱼数量建议其开放或关闭不同的捕捞区域，指导商业捕捞船到达鱼群丰富的流域而避免在鱼群稀少的水域进行作业。基因分析数据还有助于渔场管理者预测不同捕捞区域特定鱼群的数量，这样既能帮助渔场捕捞到充足的产品，又能维持足够数量的鱼回归自然。

3 用分子标记鉴定鲑鱼

　　三十多年来，渔场管理者一直依赖分子标记评估混合鱼群中不同种类的鲑鱼数量和来源，以及它们在海洋中的分布和迁徙模式。科学家们先要选择某种分子标记帮助他们建立不同种类鲑鱼的等位基因频率基准，所选的分子标记通常包括： 异构酶、线粒体DNA（mtDNA）、聚合酶链反应- 限制片段长度多态性（RFLPs）和DNA 微卫星序列。环境保护遗传学家通过跟踪等位基因频率的差异预测不同鲑鱼的迁徙模式。在过去十五年里，科学家们已经逐渐转用SNP 标记对鱼群迁徙和组成进行研究。

　　阿拉斯加渔政部的科学家们发现，SNP标签（所有生物基因组DNA 中单个碱基变化的谱图）比其他DNA 鉴定标记更易于进行实验室间的信息交流。与其他基因标记相比，SNP使世界上不同实验室间的数据比较更加准确[2]。

　　据Seeb 博士介绍， TaqMan SNP 基因检测仪能够极大地提高基因分析测试的速率，从而允许对大量的鱼类样品进行分析。此外，SNP分析可以进行活体检测，而此前的技术需要将鱼杀死。

4 等位基因酶标记的缺陷

　　最初使用分子标记的时候，遗传学家使用等位基因酶（代谢途径中同一酶的不同构型）对大多数鲑鱼种群进行研究。尽管等位基因酶有助于研究人员鉴定某一种群内个体的基因差异，可是使用等位基因酶数据用于鲑鱼种群和迁徙的研究却存在一些不足。缺憾之一是这种标记仅仅来源于大约40个不同的基因，并且只有少许染色反应可以对这些基因的酶产物进行染色。使用等位基因酶的另一个缺点是基因型检测很难自动地将其转变为遗传标记。而且，为了获得新鲜的或者冻存的组织（分析检测采集等位基因酶标记数据所需）首先需要将鱼杀死。除了上述缺陷以外，使用等位基因酶还需要非常多的遗传标记才能辨别出太平洋鲑鱼种群间的差异。

5 微卫星序列

　　微卫星序列是生物基因组非编码区不同大小的DNA 片段，也是遗传标记的一种，可以为科学家提供丰富的用于辨别鲑鱼种群的可变标记。对于基因分析而言，微卫星等位基因的数量可以达到每个位点80个以上，如此多的微卫星等位基因可以为科学家提供更多的标记差异，因此与等位基因酶标记（通常只有两个特征序列）相比，具有更强的区分鱼类种群能力。

　　然而与等位基因酶数据不同的是，微卫星序列的数据不利于实验室间的数据交流。对种群研究而言，微卫星序列中增加的类似于等位基因酶的等位基因数量实际上阻碍了基因分析数据在实验室间的共享。全球不同的实验室用于分析和采集微卫星等位基因所采用的化学反应和仪器平台各不相同。例如，微卫星分析过程中，研究人员利用所使用的工具估计碱基对的长度和重复单位的数目，以此鉴定每个标记。这些估计值具有实验室特异性，甚至在同一实验室环境中，不同的平台或仪器可能产生不同的DNA长度估计值。这种实验室与实验室之间的DNA 片段长度估计值的差异让科学家们很难使用微卫星数据建立多个实验室用于鲑鱼基因分析的共同标准。

6 SNP检测技术的应用促进了鲑鱼基因分析技术的发展

　　与研究一段碱基的微卫星标记相比，SNP数据是一组组的碱基对。这样，研究人员在利用分析工具采集SNP 序列数据的时候只会遇到4 种可能：A，C，T 或G。因此，在不同实验室以及在各种不同的化学仪器平台上可以对单核苷酸序列自动地进行标准化处理。

　　科学家们最初将DNA测序和片段分析的混合物作为样品，利用SNP 分析方法对鲑鱼基因进行测定，这是一种耗时的方法。最近，这一技术得到了发展，可以通过荧光定量方法高通量、快速地进行SNP基因分析。

　　荧光定量SNP 基因型检测技术利用荧光探针同时扩增并测定鲑鱼DNA样品，而不必在PCR 以后再进行电泳分析。通常，一小片鲑鱼鳍就能为科学家提供足够多的D N A 样品进行单核苷酸基因型检测，从而鉴定出某种鲑鱼种群迁徙经过哪个渔场。使用SNP 基因型检测可以将收集到的D N A 样品转化成数据库收录的种群鉴定标记。

　　实时PCR系统，例如7900HT 实时PCR 系统（美国应用生物系统公司），可以自动记录个体基因型并生成描绘有各个等位基因特异性探针数量的散点图，每个基因特异性标记都与相应个体基因分析的PCR 产物相关联。使用种群统计软件程序，研究人员能够将经过基因分析的未知样品归类于其最有可能的种群。包括Seeb 博士在内的一些研究人员最近在对国王鲑进行基因分析时认为，通过实时荧光定量检测产生的SNP 数据只能拟合为一条单链PCR 产物的信息，并且PCR 产物中每个位点只有两个等位基因存在，这样就不需要再进行电泳分析（实验室间数据不协调的可能原因）。如此检测到的所有等位基因都有助于检测的便利实施以及随后实验室间数据的共享[2]。

　　研究人员使用装有384孔热循环反应模块的7900HT系统对国王鲑进行研究。一个技术人员每天8 小时内进行3 次这种检测就能产生并记录下2280 个基因型。这一研究的创始人指出，通过增加更多的外部热循环模块可以显著提高检测效率[2]。并且，以增加外部热循环的方式对仪器进行简单的调整，就可以使荧光定量检测的通量能够满足实验室的需要。

　　Seeb 博士指出，使用同样的SNP 基因型检测方法，他的实验室每天可以自动地检测至少20000 个基因型（见图3 和图4）。荧光定量基因型检测作为终端检测在运行的时候允许利用外部热循环反应器进行热循环反应，然后通过7900HT系统获得结果。一个完全自动化的实验室利用一台7900HT 系统和几个384 孔热循环反应器可以进行200,000 多个基因型的检测分析。国王鲑研究的发起者断定，SNP基因型检测的高通量加上其数据便于交流的特点预示SNP 将会成为用于鲑鱼种群和迁徙研究的最重要工具[2]。

 

7 太平洋鲑鱼DNA序列信息的采集

　　研究人员发现的鲑鱼SNP 序列越多，就越有可能估计出某种特殊鱼群或渔场中未知来源鲑鱼的种类，并能更好地区分不同的鱼种，提供更好的鱼群分组结果。为了将鲑鱼基因组D N A 序列信息转换成太平洋鲑鱼S N P 基因分析标记，阿拉斯加渔政部的研究人员使用一种间接方法来发现S NP，这种方法需要将大西洋鲑鱼和彩虹鲑鱼的基因组D N A 序列数据结合起来[3]。

　　奇怪的是彩虹鲑鱼和太平洋鲑鱼属于同一种类，有着几乎相同的基因信息。由于大西洋鲑鱼和彩虹鲑鱼的大部分基因序列已被测定，Christian Smith 博士（Seeb 博士实验室的一位遗传学家）发展了一种用于发现共同序列区域的新方法，共同序列可以用于设计对太平洋鲑鱼SNP 进行鉴定的引物序列。为了找到太平洋鲑鱼SNP 序列的起始位点，Smith 博士对彩虹鲑鱼和大西洋鲑鱼的D N A 序列的排列方式进行比较。当两段序列一致时，这一相同序列也极有可能存在于某种太平洋鲑鱼中。通过这种方法，Smith 博士发现了一种太平洋鲑鱼SNP序列（每隔300个碱基对出现一次）。

8 环境对鲑鱼种群的威胁

　　有多种因素导致太平洋鲑鱼不同种群间数量的极大波动，这些因素包括：历史周期，过渡捕捞，全球气候变化，孵卵区疾病的发生以及由于采矿、伐木、筑坝和铺路等导致的逐渐恶化的生存环境。据Seeb 博士介绍，阿拉斯加布里斯托尔海湾内的红鲑正处于其历史周期中数量丰富的阶段，在过去100 年里，野生红鲑成鱼的数量最少不足50 万尾，最多可达4 千万尾。

　　全球气候变化可能已经导致了大片圆石藻的出现，这会使某些鲑鱼数量减少（见图5 ）。这些既大又厚的海藻区以一种不稳定的形式存在，它们离开阿拉斯加西海岸后在海面连绵几英里，以至阳光不能照入水下。由于鲑鱼赖以为生的浮游生物在这种没有阳光的环境下不能生长，从而导致迁徙至海藻区下方的鲑鱼被饿死。渔场管理者现在可以利用SNP 基因分析数据研究哪种鲑鱼比其他鱼种在迁徙经过海藻区时更易于受到死亡的威胁。

9 SNP基因分析数据的价值

　　对鲑鱼迁徙和鱼群组成研究而言，收集处理可靠的鲑鱼SNP 数据有助于科学家们建立标准的遗传标记数据，这些数据既可以用于鲑鱼基因分析又可以促进实验室间数据的共享，从而降低研究成本。SNP 遗传鉴定标记将会有效地帮助环保遗传学家更好地鉴别和管理多种野生太平洋鲑鱼混杂在一起的鱼群。

参考文献:

Smith CT, Baker J, Park L, Seeb LW, Elfstrom C, Abe S, Seeb JE. Characterization of 13 single nucleotide polymorphism markers for chum salmon. Molec Ecol Notes, 2005, 5: 259-62.

Smith CT, Seeb JE. Use of the 5’nuclease reaction for single nucleotide polymorphism genotyping in chinook salmon. Transactions of the American Fisheries Society, 2005, 134: 207-17.

Smith CT, Elfstrom CM, Seeb LW, Seeb JE. Use of sequence data from rainbow trout and Atlantic salmon for SNP detection in Pacific salmon. Molec Ecol Notes, 2005, 13: 4193-4203.