单细胞凝胶电泳技术影响因素的分析

单细胞凝胶电泳（SCGE）又称“彗星”法，是一种操作简便、快速、敏感性高的DNA损伤与修复的检测技术。尽管此法无需复杂的实验条件，但在建立过程中可能受诸多因素的影响而难以得到较理想的结果，我们就其主要的影响因素作如下分析。

1.琼脂糖凝胶薄板的制备：

该实验需要制备两层琼脂糖凝胶薄板，应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。第1层是紧贴冰冻玻片砂面的1%正常凝点（42±2）℃的琼脂糖凝胶，吸取85μl制成面积为18mm×18 mm，厚度为0.25mm的凝胶。

然后置4℃存放约20分钟，如时间过短，不能得到“老化”的凝胶与玻片粘合不紧，容易在液体浸泡处理和电泳过程中自然脱落，造成实验失败；反之，如果放置时间过长，凝胶极易干裂而脱落。

第2层凝胶是1%低凝点（26±2）℃琼脂糖液，与细胞混合时琼脂糖液的温度30~37℃，温度过高可引起细胞损伤，此操作过程力求快速，以免加速细胞DNA的修复。

2.细胞数和实验温度的影响：

（1）实验细胞数应调至约3.0×105，如果细胞数过低，一张片子中细胞数太少，很难完成100个彗星计数分析；反之细胞数过高，片中细胞过密，位于不同层面的细胞相互重叠，难以分析彗星DNA损伤。

（2）实验温度的控制。样品应置4℃环境下进行，以抑制或降低核酸内切酶等活性，阻止DNA损伤的修复，从而达到准确地检测DNA初级损伤。已有研究表明一些细胞DNA断裂损伤能在1小时内达到90%的修复，3小时达到97%，因此，应严格控制细胞在分析过程中的温度。

3.碱化处理及电泳的条件：

凝胶内的细胞需在碱性（pH值10）环境下进行处理，其作用一是去除细胞蛋白质，使DNA暴露出来；其次是碱化处理使DNA紧密螺旋结构解旋，DNA损伤片断及其极性端暴露出来。

电泳条件：电压或电流过大，严重受损伤的细胞可能出现的拖尾过长，彗星消失而影响结果，其次是正常的细胞可能因电压或电流过大而形成少许拖尾的假阳性结果。

反之，电压或电流过小，受损伤的细胞不会出现拖尾，而出现假阴性结果。电泳的电压多选用低电压，一般在18~50v，在电泳过程中电泳液的温度应不超过15℃（应在4℃条件下进行），电泳时间多在20~40分钟。

4.荧光染色及彗星图象分析：

（1）采用DAPI荧光剂染色，质量浓度在1~5μg/ml，用量为10μl。染色15分钟后即可观察，视野中明亮荧光的“彗星”被光照时间一般不易超过2分钟，以免荧光剂快速衰退而不宜继续观察和拍照。

（2）彗星的图像分析主要靠肉眼显微镜读片，对DNA损伤程度标准的正确判断是非常重要的。不同程度损伤可根据彗星的尾部与其头部的比率大小分为0、1、2、3、4五个等级。

0级无拖尾表明无损伤，当DNA损伤程度由轻到重，则彗星的尾部逐渐变长变大，头部逐渐变小荧光强度逐渐变弱。用肉眼观察判断的分级需要通过计算机彗星图象分析加以确定，目前已有彗星电脑分析软件可供使用，如Komet3.0等。

总之，严格控制SCGE的各种影响因素，使其真正成为一种可靠、易于掌握和有效的DNA断裂损伤和修复检测的新技术。