方群：单细胞蛋白质组学二十年梦想成真

　　由于无法对蛋白实现扩增，因此在单细胞多组学的研究中，单细胞蛋白质组学是最具挑战的研究，近年来已取得突飞猛进的进展。除了质谱仪检测灵敏度的提升，在前端取样、预处理和分离方面的巨大进步是重要因素，这和微流控技术的进步密不可分。中国的研究者研制出具有自主知识产权的单细胞蛋白质组微操控仪，在这条前沿赛道上处于国际先进水平。近日，分析测试百科网专访了浙江大学求是特聘教授、化学系微分析系统研究所所长、浙江大学杭州国际科创中心单细胞蛋白质组研究中心主任方群教授，他在2024年创立了杭州弘微新谱科技有限公司，并发布 Celleagle 赛鹰微流控单细胞操控仪。方群教授将分享自己20余年来在单细胞蛋白质组学方面的科研历程，以及产业化背后的思考与展望。

浙江大学 方群教授

单细胞蛋白质组学的最初尝试

　　自1998年研究生时期起，方群教授就踏入了微流控芯片研究领域，1999年底被引进到浙江大学化学系微分析系统研究所工作。2004年，复旦大学的杨芃原教授与浙江大学的方肇伦院士合作，最早提出开展微流控单细胞蛋白质组分析——集成化单细胞蛋白质组研究微流控芯片系统。

　　方群教授回忆道：“我们在实验室的搬迁整理旧资料时，偶然发现了这份 2004 年的合作协议。当时，两家单位在没有任何资助的条件下开始合作，后来在2005年一个973项目中获得了一项2.4万的子课题项目资助。”

　　当时，常规的蛋白质组学分析需要几万个细胞做一次测定；开展单细胞蛋白质组学研究，无论是微流控技术还是质谱的灵敏度都受到很大限制，两年的尝试下来，试验没有获得很好的结果。方群教授的研究方向又重新回到微流控技术。

发明SODA

　　方群教授回忆道：“我们做了十年的微流控研究，2009-2010 年时，我们开始反思自己的研究：虽然发表了很多高质量的文章，也做了很多创新性的工作，但总觉得还缺少一些实际应用的落地。”这时，斯坦福大学的Stephen Quake教授访问浙江大学，他的研究方向从微流控技术转向了单细胞测序。方群教授从他的经历中得到了启发：“Quake教授做微流控研究的初衷是为了找到一个合适的生物医学工具，当他找到这个工具后，就转向了实际应用。这让我意识到，我们不能仅仅停留在发表文章上，还需要将微流控技术真正推向实际应用。”

　　要实现微流控芯片的广泛应用，必须要解决芯片的通用性和灵活性问题。“很多微流控芯片的特点是千人千面，比较个性化，为不同的应用需设计不同的芯片，因此，芯片常常没有通用性，没有普适性。”方群说，“微流控的核心在于微流体的操控，如果将这个关键核心抽提出来，形成微流控方法的创新，就有可能实现通用性的应用。”

　　2013年，方群团队研发出序控液滴阵列技术技术（Sequential Operation Droplet Array, SODA)。SODA系统能够通过吸-点-移三个单元操作的灵活组合，在皮升精度水平自动化地完成多步复杂的液滴操控，包括液滴生成、转移、融合、分裂、寻址、分选等。“简单来说，SODA通过移动平移台，靠近样品时用一根毛细管吸取纳升到皮升级微量的液体，然后推出液滴，并在液滴上面盖油防止其蒸发。这样，SODA就形成一个非常微小的化学反应器。顺序进行取液，反应，再取液再反应，即能实现复杂多步的微反应。”SODA系统的独特之处在于其高度的灵活性、通用性和兼容性，能够适应多种应用场景。经过多年的优化和改进，SODA系统逐渐成型，并在单细胞分析、高通量筛选、现场分析等领域展现出巨大的潜力。

SODA迭代升级：单细胞蛋白质组学研究利器

　　2014 年，方群团队与上海国家蛋白质科学中心的雷鸣研究员合作，用SODA进行蛋白结晶条件的筛选，机缘巧合认识了黄超兰研究员。黄超兰研究员曾在美国斯克里普斯研究所从事博士后研究工作，师从John Yates 教授，对质谱和蛋白质组学研究有非常丰富的经验。双方一拍即合，决定再次挑战单细胞蛋白质组学研究。

　　合作中，黄超兰研究员展示了常规蛋白质组学的样品处理过程，包括细胞破膜、还原烷基化、酶解等至少 7 步操作，最多可达 7 步到 11 步。SODA系统的特长在于进行复杂多步微反应，很适合完成上述操作。但如何防止如此微小的液滴在操作过程中的蒸发损失？为此，团队设计了一种原位液滴反应器，将纳升级液滴固定在原位进行反应，并在液滴上方隔着空气覆盖一层油以防止蒸发，构成了纳升级油-气-液滴（OAD）芯片。同时，他们还针对单细胞蛋白质组分析的各个流程进行了优化。

　　经过四年的艰苦努力，2018年，双方合作首次实现了哺乳动物体细胞的单细胞蛋白质组分析，并在《Analytical Chemistry》上发表了这一突破性成果^【1】。

　　“当时许多人都觉得单细胞蛋白质组学不可能实现。因为2004年我们自己挑战失败过；而2014年几万个细胞才能鉴定数千种蛋白质。”方群回顾说，“非常感谢黄老师的合作和鼓励，感谢我的博士生李紫艺坚持了4年，我本人可能属于‘无知者无畏‘，更多考虑地是如何减少单细胞样品在这些多步复杂前处理过程中的样品损失。多年的微流控研究经验告诉我们，微流控系统有显著的尺度效应，其中之一是当系统尺度减小10倍后其比表面积增大10倍，会导致管路的吸附效应远大于常规体系。我一直有个猜想，之前单细胞蛋白质组分析不成功，也可能并不完全是质谱仪的灵敏度不够，也有可能是在复杂多步的蛋白质组样品预处理中，极其微量的单细胞样品被损失掉了。基于这种考虑，我们没有采用常见的微流控芯片流动通道的模式，而是设计了基于SODA技术的原位液滴反应器配合基于毛细管探针的液体操控系统，包裹单细胞的液滴一直不动，利用毛细管探针在原位进行多步反应，其后再用气压将反应后的液滴推进毛细管液相色谱柱，进行液质联用分析。”

用于单细胞蛋白质组分析的样品前处理和进样的流程图

　　这种微型化的油-气-液（OAD）芯片及相应的纳升级液体操控和进样方法，能够在原位静态的纳升级液滴中完成多步样品前处理，并将液滴样品直接高效地注入到色谱分析柱内完成后续的LC-MS分离检测。通过采用优化后的实验条件，该系统成功地从1个HeLa细胞内鉴定出51种蛋白质。

　　“在单个鼠卵细胞的蛋白质组分析中，我们对比了OAD芯片与常规离心管做反应器的结果，离心管最多鉴定30种蛋白质，而OAD芯片可鉴定355种蛋白质。这证明了单细胞蛋白质组学的主要挑战来自于样品前处理的损失。实验结果给了我们很大的鼓舞。”方群说。

　　“基于上述结果，我们申请并获得了国家重大仪器研究研制项目（基于微流控液滴技术的自动化、多模式单细胞分析系统的研制）的支持，自主研发了四台三代应用于单细胞蛋白质组分析的SODA系统，在2024年结题时被评为“优秀”。

　　方群研究组在浙江大学继续优化SODA系统，采用商品化内插管替代OAD芯片作为纳升级微反应器，以方便操作和直接兼容LC-MS系统的自动进样器。该系统采用“所见即所得”的操作方式，借助显微镜确定目标细胞后进行原位单细胞挑选，再进行多步的样品预处理反应，将最终酶解后的多肽移入进样瓶，进行液质联用分析。配合浙江大学实验室购买的高灵敏度质谱仪，团队对单细胞蛋白质组学的5大关键流程进行优化，包括：细胞捕获、样品前处理、色谱分离、质谱检测、数据处理，最后发展出“点取式”单细胞蛋白质组分析流程（PiSPA），首次在单个哺乳动物细胞中实现了高达3000种蛋白质的超高定量深度，研究成果在2024年《Nature Communication》上发表^【2】。

“点取式”单细胞蛋白质组分析流程示意图

　　关于为何从微流控转向单细胞蛋白质组研究，方群谈到两点原因。首先，从人类认识世界的角度看，在单细胞水平上去认识细胞功能的实际执行者——蛋白质是必须经过的一个阶段。其次，从单细胞转录组技术的发展可预知单细胞蛋白质组技术的未来。2009年人们第一次获得单细胞转录组的结果，2012年获得12%的测序深度，2015-2016年，由于微流控液滴技术和核酸编码技术的引入，使得几千上万个单细胞样品的转录组高通量测序成为可能。其后，单细胞转录组研究呈现爆发式发展，年发表文献已超过3,000篇。单细胞蛋白质组研究在2018年实现了方法的突破。近两年，单细胞蛋白组分析已经达到了13%-20%鉴定深度，已经达到10年前单细胞转录组测序技术的相近水平。类比单细胞转录组测序技术的发展历史，可以预见当前已处于单细胞蛋白质组分析技术的爆发阶段。方群说到：“这是我做产业化的初衷。而且从认识论角度说，蛋白质是生物功能的实际执行者，和生物功能更直接相关；由于翻译过程中影响因素众多，从转录组数据往往并不能直接推导出蛋白质组的结果。因此，人类必然要在单细胞层面认识蛋白质组，这应该是生物医学专家们更需要了解的结果。”

产业化之路：从实验室到市场

　　2024 年，方群教授创立了杭州弘微新谱科技有限公司，并发布了 Celleagle 赛鹰微流控单细胞操控仪。针对单细胞分析，可以提供一套包含自动化单细胞精准分选与捕获、样品预处理、蛋白质组学分析在内的完整解决方案。

Celleagle赛鹰 微流控单细胞操控仪

　　赛鹰单细胞操控仪采用细胞成像与探针操控结合的方式进行单细胞的分选-捕获操作，与市场上其它仪器相比，对目标细胞捕获的指向性、确定性和可靠性均很高，还可以把细胞样品的明场表观形态、荧光成像、运动行为、空间位置等多维信息与深度的蛋白质组信息整合起来，开展更加深入的分析和研究。利用赛鹰单细胞操控仪，方群团队通过观察细胞迁移距离的差异，并对不同迁移行为的细胞进行单细胞蛋白质组分析，再比较其蛋白质水平上的差异。最近他们的一项研究发现了肿瘤细胞的耐药异质性规律。当用药物刺激肿瘤细胞时，虽然90%的肿瘤细胞会被杀死，但仍有一些细胞会存活。将每个存活的单细胞挑出来，再做荧光成像和单细胞蛋白质组分析，发现了两类存活细胞：一类是代谢降低的“冬眠”细胞，另一类是活性高且耐药的细胞。对这些耐药细胞的研究，有可能找到肿瘤复发和转移的关键原因。

　　“现在的赛鹰系统针对单细胞蛋白质组学研究的高端客户，比如科研单位、第三方实验室，这些客户更希望获得的是全套解决方案。“方群表示，“我们可提供整体解决方案，包括仪器、探针、试剂盒、微反应器、恒温孵育箱等，甚至自主研发的高性能色谱柱。还大大简化了样品前处理操作，客户只需要进行一步样品前处理操作，就可获得稳定的深度覆盖的单细胞蛋白质组分析结果。我们还希望推动建立单细胞蛋白质组领域的生态圈，吸引更多研究者使用这一技术，使它像单细胞转录组技术那样得到广泛的普及并在生物医学的研究和应用中起到重要作用。我希望我们的仪器能够在这方面起到一些促进作用。“

　　利用赛鹰单细胞操控仪，方群团队还与浙江大学良渚实验室、浙江大学附属第二医院、邵逸夫医院、妇产科医院、浙江省肿瘤医院等多家单位建立了合作关系，开展肺癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、鼠卵细胞、干细胞等各类样品的单细胞蛋白质组学研究。比如近期发表在《Advanced Science》^【3】上的研究可实现单细胞的靶向配对及互作研究，对免疫细胞与癌细胞的相互作用进行了深入探讨。

　　最后方群表示：团队将进一步提高单细胞蛋白质组分析的鉴定深度和通量，以持续推进该技术的实用化水平。我们还将与生物医学专家们合作，拓展该技术在生物学、医学和药学等领域的深度应用，推动单细胞蛋白质组学技术的快速发展和应用普及。

　　【参考文献】

　　1.Z-Y. Li, M. Huang, X-K. Wang, Y. Zhu, J-S. Li, C. C. L. Wong*, Q. Fang*, Nanoliter-scale oil-air-droplet chip-based single cell proteomic analysis, Anal. Chem., 2018, 90, 5430-5438. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b00661

　　2.Y. Wang, Z-Y. Guan, S-W. Shi, Y-R. Jiang, J. Zhang, Y. Yang, Q. Wu, J. Wu, J-B. Chen, W-X. Ying, Q-Q. Xu, Q-X. Fan, H-F. Wang, L. Zhou, J. Fang J-Z. Pan, Q. Fang*, Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammalian cell. Yu Wang,

　　Qun Fang. Nat. Commun., 2024, 15, 1279. https://doi.org/10.1038/s41467-024-45659-4

　　3.Q-Q. Xu, Y-R. Jiang, J-B. Chen, J. Wu, Y-X. Chen, Q-X. Fan, H-F. Wang, Y. Yang*, J-Z. Pan*, Q. Fang*, Single cell-pair proteomics for decoding immune-cancer cell interactions. Adv. Sci. 2025, 2414769. https://doi.org/10.1002/advs.202414769