单细胞分析之全攻略步骤

分离单个细胞

在您研究单个细胞之前，您需要将它可靠地分离。显微抽取、流式细胞术（FACS）、激光捕获显微切割（LCM）都可用来收集单个细胞。每种方法都各有利弊。FACS将细胞分选到PCR板上，与RT-qPCR仪器兼容。此外，FACS可利用特定的细胞标志物实现细胞富集。FACS的通量也比LCM高得多，但缺点是你无法观察细胞，确定重要参数，如细胞形态。FACS还需要单细胞悬液，因此，细胞的过去无从知道。

德克萨斯大学MD Anderson癌症中心的助理教授Nicholas Navin一般使用FACS来分离单个循环肿瘤细胞（CTC）。如今，Navin的实验室也利用一些新工具来分离CTC，以便研究单细胞基因组学，这些新工具包括Fluidigm的C1单细胞自动制备系统和Silicon Biosystems的DEPArray系统。他认为，FACS能够分离群体中低至0.1%的细胞，但除此之外，你还需要一个类似DEPArray的系统，从10万个细胞中分离出1个。

意大利Silicon Biosystems公司将利用DEP技术操控单个细胞的能力与基于高质量图像的细胞选择结合在一起，开发出DEPArray系统。这一自动化的平台让用户能够从复杂的异质样品中鉴定和回收单个目的细胞。

DEPArray系统利用非均匀电场对细胞施力，并结合形态学的信息，实现单个细胞的捕获、操控和回收。整个过程无物理接触或摩擦，保持了细胞活性，这样获得的细胞可以继续培养或者应用于表达谱、测序、拷贝数变异等分析。此系统可分析包含一个至数万个细胞的样品，与各种细胞悬液兼容，也能处理细针穿刺和组织活检样本。Fluidigm的C1单细胞自动制备系统虽不能观察图像，却强调了整个过程的自动化。它可以同时捕获96个的细胞，在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程。整个过程无需任何手动的溶剂混合及样品转移操作。预扩增的cDNA 产物被收集出来，可转移到 BioMark HD 系统中再进行定量 PCR 分析。这样，几个小时内即可检测数以百计的单细胞中数百个基因的表达。而自动化的流程免除了繁重的加样和样品混合步骤，轻松做到“加样走人”。索取更多资料

单细胞基因组学

Navin的实验室对来自乳腺肿瘤的单细胞基因组进行测序，以便了解肿瘤发生、耐药和转移过程中肿瘤如何变化。Navin认为，尽管单细胞的转录组（RNA-Seq）或基因组（DNA-Seq）测序方法近期不断涌现，但这一领域仍面临重要的技术问题，即如何区分变异和技术错误。错误通常来自于遗传材料的扩增。不扩增？那又不行。单细胞中只有那么一丁点RNA，至少需要几个循环的扩增。在研究单细胞转录组时，RNA水平的差异可能会被误认为是细胞之间的差异。此外，DNA扩增过程中也会出现假阳性，因为DNA聚合酶天生容易出错。因此，Navin认为，关键要在研究和报告生物学变异之前，对所用方法的错误率有着很好的了解。他希望，今后单分子测序的改善能让我们直接测定单个细胞中的突变，而无需扩增。

当然，测序技术也在不断进步。哈佛大学华裔学者谢晓亮（Sunney Xie）教授去年底在《Science》杂志上发表了一项单细胞测序的新技术。在新研究中，谢晓亮教授和同事们开发了一种称为MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles）的技术，使得他们能够测序单个人类细胞93%的基因组。在MALBAC中，研究人员首先分离出来自单细胞的DNA，然后添加作为引物的短DNA分子。这些引物可与DNA的随意部分互补，从而使得它们能够附着到DNA链上，充当DNA复制起点。这些引物由两个部分构成——一个包含8个核苷酸的粘性部分变化多样，可与DNA结合，再加上一个包含27个核苷酸的共同序列。这一共同序列可防止DNA太多次拷贝，大大地降低了扩增偏倚。当然，尽管MALBAC相比其他技术对基因组的覆盖更为完全，但并不。它仍然错过了大约三分之一的单核苷酸变异。此外，复制DNA的酶容易出错，因此复制过程本身可以引入不存在于细胞中的变异。Nicholas Navin认为，研究人员需通过比较来自三个密切相关细胞的单个测序基因组，才能够去除所有的假阳性。这样将会增加成本，可能不适合某些组织样品。

正如世界上没有两片相同的树叶，世界上也没有两个相同的细胞。群体的平均值虽然有用，但无法准确反映单个细胞的表型，它们有时差异甚大。而这些表达上的差异也许包含了重要的信息，有助于我们了解癌症、确定治疗是否有效、鉴定免疫反应等。近两年，单细胞分析发展迅速，文章数以每年40%的速度增长。单细胞方法让微生物学家能够着手研究无法培养且数量有限的微生物，同时也让干细胞研究人员能够深入了解细胞的编程和分化。这一切，都多亏了分析工具的快速发展，比如细胞分离、单细胞测序、单细胞蛋白质组学和转录组学以及高内涵成像。